Macam Isolasi dari Mikroorganisme Laut

Isolasi senyawa aktif dari mikroorganisme laut dapat melalui beberapa cara

Berikut ini contohnya :

- Isolasi Dan Identifikasi Bahan Aktif Penyebab Pemancaran Cahaya Pada Bakteri Photobacterium Phosphoreum Yang Diisolasi Dari Cumi Laut Jepara Indonesia

Metoda yang digunakan dalam penelitian ini melibatkan isolasi, pemurnian, elektroforesis, pengukuran serapan dan pengukuran pemancaran cahaya maksimum. Cahaya yang dipancarkan oleh cumi disebabkan adanya hubungan simbiosa antara cumi-cumi jenis Laligo duvaucelli dengan bakteri Photobacterium phosphoreum yang hidup di dalamnya. Luciferase dari bakteri Photobacterium phosphoreum yang diisolasi dari cumi laut Indonesia selanjutnya disingkat LBPP.

Metode penelitian :

Penelitian ini dilakukan di laboratoriun Biofisika, Institut Teknologi Bandung dan laboratorium Fisika, Universitas Negeri Padang. Semua reagen kimia yang diperlukan untuk isolasi dan identifikasi bahan aktif Photobacterium phosphoreum ini seperti FMN beserta pereduksinya (sodium hidrosulfida (dithionit)), aldehyd (n-decyl aldehyde), DEAE-cellulosa, Gel filtrasi kromatografi Sephadex G-100 didapatkan dari Sigma Chemical Company. Eksperimen dilakukan dalam buffer fosfat pada pH 7,0. dan merupakan campuran dari 1.0 M K2HPO4 dan 1.0 M NaH2PO4, larutan yang dibuat dengan konsentrasi berbeda sesuai dengan keperluan. Bakteri Photobacterium phosphoreum diisolasi dari cumi spesifik Indonesia jenis Loligo duvacelli. Bakteri ini dikultur pada medium padat yang terdiri dari 3 g extract Bacto, 5 g peptone-bacto, 15 g agar bacto, 30 g NaCl, 3 ml glyserol; 1 liter air suling dan NaOH secukupnya untuk mengatur pH 7.0. Kultur dilanjutkan pada 5 liter medium cair yang terdiri dari 1 liter air suling; 30 g NaCl, 14 g Na2HPO4.7H2O, 2 g KH2PO4, 0,5 g (NH4)2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 3 ml glyserol, 5 g triptone bacto, 5 g ekstrak ragi bacto dan NaOH secukupnya untuk mengatur pH 7.0. Proses penumbuhan bakteri Photobacterium phosphoreum dilakukan dengan mengukur secara langsung kultur dengan metode spektrofotometer. Sebanyak satu ose bakteri Photobacterium phosphoreum ditanam dalam media padat dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam hingga terbentuk koloni tunggal. Koloni tunggal tersebut dicuplik dan diinkubasi ke dalam 100 ml media cair selama 20 jam dengan kecepatan putar 200 rpm pada suhu kamar. Sebanyak 4,5 ml kultur hasil inkubasi pada media pertama dipindahkan ke dalam 450 ml media cair kedua dan diinkubasi dengan kecepatan putar 200 rpm pada suhu kamar selama 20 jam. Seiring berjalannya inkubasi secara bersamaan dilakukan sampling pengukuran waktu untuk mengetahui kerapatan sel setiap dua jam selama 24 jam. Hasil sampling tersebut ditentukan dengan spektrofotometer UV-Vis (Ultraviolet-Visible) pada panjang gelombang 660nm. Sel dipanen pada kerapatan sel 4x10-9 sel/ml. Untuk memperoleh ekstrak kasar, sampel hasil sampling, disentrifugasi dengan kecepatan putar 6000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 0C, agar cairan fermentasi dan supernatannya terpisah. Supernatan dicuci dengan air suling dingin sebanyak tiga kali untuk menghilangkan sisa-sisa media dan sel-sel yang mati. Setiap kali pencucian, dilakukan

sentrifugasi dan penimbangan untuk mengetahui berat molekul supernatan yang tertinggal. Kemudian supernatan tersebut disuspensi dalam larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7 (sebanyak 1 gram sel basah dalam 5 ml buffer fosfat) selama 20 jam. Supernatan yang telah disuspensi tersebut dipecah dengan alat sonikasi selama 5 menit dalam keadaan dingin sebanyak 5 kali. Hasil sonikasi diinkubasi kembali selama 1 jam, yang selanjutnya disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan putar 12000 rpm pada 40C. Ekstrak kasar yang diperoleh ditentukan aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Untuk mengendapkan protein yang ada di ekstrak kasar dilakukan fraksionasi ammonium sulfat dengan derajat kejenuhan 25-85 %. Penambahan ammonium sulfat dilakukan sambil mengaduk-aduk larutan ekstrak kasar secara perlahan dengan pengaduk magnet pada suhu 4 0C. Larutan ekstrak kasar kemudian didiamkan selama satu malam sambil diaduk secara perlahan agar pengendapan berlangsung sempurna. Untuk memisahkan endapan dengan supernatan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan putar 7000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh ditentukan aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Selanjutnya, LBPP dimurnikan menggunakan kolom dietilaminoetil cellulosa (DEAE cellulosa) ukuran 2x45cm yang diregenerasi dengan 200 ml larutan NaCl pada konsentrasi 2M. DEAE cellulosa dicuci dengan 2 liter air suling dingin dan disetimbangkan dengan 2 liter larutan buffer fosfat pada pH 7,0 dan konsentrasi 0,02 M. DEAE cellulosa harus selalu dijaga pada PH 7,0. Selanjutnya 10 ml sampel LBPP dimasukkan kedalam kolom dan kemudian dielusi dengan larutan buffer fosfat. Elusi ini bertujuan untuk mengikatkan LBPP pada matrik DEAE cellulosa. Protein lain yang tidak diinginkan dibiarkan melewati kolom. LBPP yang terikat pada kolom dielusi dengan gradien NaCl sebanyak 200 ml dengan konsentrasi 0,5 M dan ditampung dalam fraksi-fraksi dengan kecepatan 1 ml/menit. Untuk mengetahui fraksi-fraksi yang mengandung LBPP dilakukan pengukuran serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Setelah pola serapan LBPP diketahui, kemudian diuji aktivitasnya dan konsentrasinya. Fraksi-fraksi yang ada aktivitasnya digabung dalam sebuah tabung reaksi dan dipekatkan dengan ammonium sulfat pada 40-75 % saturasi.

Untuk mendapatkan LBPP kemurnian tinggi digunakan gel filtrasi kromatografi Sephadex G-100 berukuran 2x60cm. Kolom gel tersebut diseimbangkan selama satu malam dengan 0.35 M buffer fosfat pada pH 7.0. LBPP yang telah dipisahkan dari DEAE cellulosa dielusi dengan 0.02 M buffer fosfat pada pH 7.0 dan ditampung dalam fraksi-fraksi dengan kecepatan 1 ml/menit. Untuk mengetahui fraksi-fraksi yang mengandung LBPP dilakukan pengukuran serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Setelah pola serapan LBPP diketahui, kemudian diuji aktivitasnya dan konsentrasinya. Fraksi-fraksi yang ada aktivitasnya digabung dalam sebuah tabung reaksi dan dipekatkan dengan ammonium sulfat pada 40-75 % saturasi.

Penentuan aktivitas dilakukan dengan cara mengukur intensitas cahaya maksimum dari fraksi-fraksi LBPP menggunakan alat spektrofotometer fluorosensi model F-2000. Satuan aktifitas dinyatakan dalam quanta sec-1 ml-1 dan satuan aktifitas spesifik dalam quanta sec-1

mg-1. Satuan aktivitas total dinyatakan dalam quanta sec-1 yang diperoleh dari perkalian kecepatan per satuan mg enzim dengan mg enzim. Kondisi yang diperlukan agar terjadi proses biolumunisensi adalah 1 ml dari 5x10-5 M FMNH2 dimasukkan kedalam 1,2 ml campuran LBPP, 100 µL dodekanal, O2 dan 0,02 M buffer fosfat pH 7. Pengukuran aktivitas biolumunisensi dilakukan pada kondisi pada 25 0C dimana FMNH2 harus diinjeksi secara cepat. Setiap fraksi-fraksi LBPP seperti ekstrak kasar, fraksionasi pada 25-85% saturasi, DEAE cellulosa, gel filtrasi, diuji aktivitasnya sesuai langkah-langkah yang telah dijelaskan. Konsentrasi protein diuji menggunakan metode Lowry, dengan bantuan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Absorbansi pada 750 nm digunakan sebagai dasar pengujian konsentrasi protein. Untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim setelah pemurnian, maka dilakukan elektroforesis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Karakterisasi sifat-sifat fisika dari LBPP dilakukan dengan mengukur spektrum serapan (eksitasi) dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan spektrum pemancaran cahaya dengan menggunakan spektrofotometer fluorosensi model F-2000.

- Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan

Metode yang digunakan adalah metode survei, dengan mengamati bakteri probiotik pada sampel organ pencernaan ikan kerapu macan. Sampel udang windu yang digunakan berukuran 250-400 g diperoleh di Loka Budidaya Laut Batam.

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah media agar non selektif TSA (Tryptone Soya Agar), Difco, MR-VP Broth, reagen methyl red, TSI (Triple Sugar Iron) agar, bahan untuk uji pewarnaan Gram (crystal violet, lugol iodine, safranin, etil alkohol 95%, dan aquades), hydrogen peroksida (H2O2), larutan naftol (1 g per 100 ml etil alkohol) dan larutan phenilendiamin (1 g per 100 ml air destilasi).

Alat-alat yang digunakan antara lain: inkubator, autoklaf, erlenmeyer, pemanas, alumunium foil, lampu Bunsen, cawan petri, neraca Ohauss dengan ketelitian 0,1 g, gelas ukur, tabung reaksi, kapas, motor steril, pipet (0,1, 1,0 dan 10 ml) dan pro pipet, janke dan kunkel, mikroskop binokuler,gelas objek, glass speader, jarum oase dan colony counter. Analisis dan identifikasi bakteri pada sampel dilakukan di laboratorium mikrobiologi laut.

Ikan kerapu macan dibedah secara aseptis untuk diambil organ pencernaannya (lambung dan usus) lalu dimasukkan ke dalam larutan fisiologis (NaCl 0,9%) pada pH 2, dengan tujuan hanya bakteri probiotik yang dapat tumbuh dan berkembang pada pH tersebut. Selanjutnya dilakukan penanam bakteri pada media kulur TSA. Setelah diperoleh koloni yang mampu hidup pada media bakteri heterotrof, maka setiap koloni yang diperoleh dibuat tiga ulangan. Akhirnya dari beberapa kali pengulangan, minimal lima kali ulangan untuk setiap strain, ditemukan isolat murni dari bakteri heterotrof yang potensi sebagai probiotik. Kemudian dilanjutkan dengan identifikasi isolat. Penyimpanan koloni bakteri dilakukan pada suhu 40C dan siap untuk digunakan pada pengujian

selanjutnya. Identifikasi bakteri dilakukan terhadap isolatisolat yang diperoleh dengan berpedoman pada buku Bergey’s Determinative Bacteriology (Holt et al, 1994) dengan melakukan serangkaian uji morfologi dan biokimia yaitu uji pewarnaan Gram, uji motilitas, pengamatan bentuk sel, tipe penggandengan sel, sifat aerobik dan anaerobik, kemampuan tumbuh pada suhu 50C, 200C, dan 300C. Pengamatan dilakukan juga pada warna koloni, ukuran koloni, bentuk koloni yang dilihat dari dalam, samping dan atas, kemampuan memproduksi katalase dan oksidase, uji halofilik dan oksidase sitokrom untuk menentukan genus bakteri heterotrof yang didapat dari ikan kerapu macan.

- Isolasi dan elusidasi struktur senyawa utama dari sponge Axynissa aplysinoides

Telah dilakukan isolasi senyawa utama dari sponge Axynissa aplysinoides yang diperoleh dari perairan laut Lombok. Ekstrak metanol sponge yang telah dikeringkan difraksinasi kedalam fraksi non polar, semipolar dan polar, masing-masing dengan menggunakan heksan, etil asetat dan butanol. Identifikasi dan isolasi senyawa dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Elusidasi struktur isolat dilakukan dengan menggunakan spektrometri massa (SM-EI) dan spektrokopi resonansi magnetik inti proton dan karbon (1H- dan 13C-RMI). Senyawa utama diidentifikasi sebagai (E)-(4-hidroksistiril trimetilamonium)

Sampel yang telah dikeringkan (14 g) diekstraksi menggunakan metanol (MeOH). Ekstrak MeOH kemudian difraksinasi cair-cair dengan pelarut heksan, etil asetat dan butanol. Terhadap masing-masing fraksi kemudian dilakukan analisa KCKT (Knauer) dengan kolom fase balik (reverse phase) C-18, 125 x 4 mm (Eurospher, prepacked) dengan detektor Photo Dioda Array (UVD 340S Gynkotec) untuk menentukan keberadaan senyawa utama. Fase gerak menggunakan campuran metanol–air dengan sistem gradien (Tabel.I) dengan kecepatan alir 1 mL/menit.

Proses isolasi diawali dengan melakukan kromatografil kolom fraksi butanol. Fase diam yang digunakan adalah sephadex LH 20 (Sigma) dengan fase gerak MeOH 100%. Terhadap masing-masing subfraksi hasil kromatografi kolom dilakukan analisa KCKT untuk merunut keberadaan senyawa utama. Fraksi yang mengandung senyawa utama selanjutnya dilakukan KCKT preparative (Hitachi) untuk mengisolasi senyawa utama.

Tabel I. Komposisi fase gerak dalam analisa KCKT

Waktu (menit)           Prosentase Pelarut

                                    Metanol     Air

0                                      0           100

10                                    0           100

12                                    5            95

20                                    5            95

22                                   10           90

25                                   10           90

27                                   30           70

30                                   30           70

32                                   60           40

35                                   60           40

40                                   100          0

45                                   100          0

Elusidasi struktur senyawa utama hasil isolasi dilakukan dengan menggunakan Spektrometer Massa (Finnigan TSQ 7000), 1H- dan 13C-RMI (Bruker ARX 400, 100 MHz dan 400 MHz).

- Isolasi Dan Karakterisasi α-Amilase Dari Bakteri Laut Vibrio sp. SFNB 3

α-Amilase (E.C 3.2.1.1) menghidrolisis secara acak ikatan α-1,4-O-glikosidik dari pati, glikogen, dan polisakarida lain untuk menghasilkan dekstrin, oligosakarida, maltosa dan glukosa. Enzim ini menyumbang sekitar 30% dari total produksi enzim dunia dan mempunyai aplikasi yang luas di dalam industri. Beberapa industri yang menggunakan α-amilase adalah industri pengolah pati, makanan, pemeraman, deterjen, tekstil, dan kertas. Tiap aplikasi industri mensyaratkan sifat yang khas dari α-amilase terkait dengan spesifisitas, stabilitas, dan pengaruh suhu serta pH terhadap aktivitasnya. Saat ini, hidrolisis enzimatis pati mentah sangat diperlukan untuk menekan konsumsi energi di dalam industri yang berbasis pati. Eksplorasi sumber-sumber baru penghasil α-amilase dan karakterisasi α-amilase yang dihasilkannya penting dilakukan untuk memfasilitasi penemuan α-amilase baru yang memenuhi persyaratan industri dengan kemampuan yang lebih baik, terutama dalam mendegradasi pati mentah. Salah satu sumber potensial penghasil α-amilase yang belum banyak dieksplorasi adalah bakteri laut. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mempelajari karakteristik biokimiawi α-amilase dari bakteri laut Vibrio sp. SFNB 3.

Pada suhu 30oC dan penggoyangan 150 rpm, Vibrio sp. SFNB 3 memiliki fase pertumbuhan yang singkat dan pada jam ke-6 inkubasi fase stasioner telah dicapai. Sintesis α-amilase ekstraseluler oleh Vibrio sp. SFNB 3 berjalan mengikuti pertumbuhan selnya sehingga termasuk ke dalam tipe sintesis growth associated. Vibrio sp. SFNB 3 menghasilkan lebih dari satu jenis α-amilase dengan aktivitas spesifik terhadap pati terlarut 11 U/μg di bawah kondisi uji. Salah satu diantara α-amilase tersebut mempunyai kemampuan pengikatan pati mentah jagung. Isolasi α-amilase dari Vibrio sp. SFNB 3 dengan menggunakan pati mentah jagung memberikan yield sebesar 30% dengan tingkat kemurnian 2 kali lipat. Aktivitas spesifik α-amilase hasil isolasi terhadap pati terlarut adalah 21 U/μg di bawah kondisi uji.

Penentuan massa molekul dengan menggunakan SDS PAGE menunjukkan bahwa α-amilase hasil isolasi mempunyai massa molekul sekitar 51 kDa. Profil suhu-aktivitas menunjukkan bahwa α-amilase hasil isolasi memiliki rentang suhu yang lebar untuk aktivitasnya. Pada rentang suhu 30-60oC, α-amilase hasil isolasi memiliki aktivitas relatif diatas 88%. Suhu optimum untuk aktivitas α-amilase hasil isolasi adalah 50oC. Nilai T1/2 dari α-amilase hasil isolasi pada suhu ini adalah 194 menit. α-Amilase hasil isolasi dapat bekerja pada rentang pH yang lebar. Pada rentang pH 5 hingga pH 8, α-amilase hasil isolasi memiliki aktivitas relatif diatas 85%. Profil pH-aktivitas dari α-amilase hasil isolasi menunjukkan aktivitas optimum dicapai pada pH 8. α-Amilase hasil isolasi merupakan endo amilase dan mendegradasi pati terlarut dengan rentang produk yang lebar, dari glukosa hingga maltoheptaosa (G1-G7), setelah 48 jam inkubasi pada suhu 50 derajat C. α-Amilase hasil isolasi memiliki kemampuan pendegradasian pati mentah jagung, menghasilkan maltosa hingga maltoheptaosa (G2-G7) setelah 72 jam inkubasi pada suhu 37 derajat C dan penggoyangan 150 rpm. Pemindaian mikroskop elektron (SEM) menunjukkan adanya pori-pori dan lubang-lubang besar pada permukaan granula pati mentah jagung akibat hidrolisis enzimatik oleh α-amilase hasil isolasi. Nilai Km, Vmax dan kcat α-amilase hasil isolasi adalah 10,7 mg/mL, 303 U/mL dan 5 x 104 s-1, berturut-turut. Berdasarkan karakteristik ini, α-amilase hasil isolasi dari bakteri laut Vibrio sp. SFNB 3 memiliki potensi yang besar untuk aplikasi industri, terutama industri yang berbasis pati.

Daftar pustaka :

Mahatmanto, Tunjung, 2008, Jurnal : Isolasi Dan Karakterisasi α-Amilase Dari Bakteri Laut Vibrio sp. SFNB 3, Bandung, Jawa Barat.

Sumaryono, Wahono; Agung Eru Wibowo; Chaidir, 2005, Isolasi Dan Identifikasi Bahan Aktif Penyebab Pemancaran Cahaya Pada Bakteri Photobacterium Phosphoreum Yang Diisolasi Dari Cumi Laut Jepara Indonesia, Majalah Farmasi Indonesia, 16(4), 186 – 191.

Ratnawulan; Delianis Pringgenis; Idam Arif, 2005, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan, Makara, Sains, Vol. 9, No. 1, April 2005: 13-18

Feliatra; Irwan Effendi; Edward Suyadi, 2004, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan, Jurnal Natur Indonesia 6(2): 75-80.