Isolasi senyawa dari actinomycetes

I. PENDAHULUAN
Actinomycetes merupakan bakteri Gram positif dengan siklus hidup yang kompleks yang didistribusikan secara luas di ekosistem darat, khususnya ditanah. Bentuknya berupa untaian abu-abu di tumpukan vegetasi yang membusuk, seperti untaian jamur. Actinomycetes pada awalnya diklasifikasikan sebagai jamur, meskipun sekarang dianggap sebagai bentuk bakteri. Dalam dekade terakhir, Actinomycetes laut semakin sering terisolasi dari lingkungan laut. Hal ini menunjukkan bahwa Actinomycetes berada dimana-mana di sedimen laut, tetapi jumlahnya lebih rendah dibandingkan yang berada di tanah. Selain itu, Actinomycetes laut telah ditemukan dalam simbiosis dengan beberapa invertebrata laut, terutama spons. Actinomycetes ini mempunyai daya tarik besar, karena metabolismenya yang unik dan mempunyai kemampuan fisiologis yang berpotensi menghasilkan metabolit sekunder dengan aktivitas farmakologi yang menarik. Actinomycetes terbagi dalam beberapa genus yang meliputi, Dietzia, Rhodococcus, Streptomyces, Salinispora, Marinophilus,Solwaraspora, Salinibacterium, Aeromicrobium marinum, Williamsia maris and Verrucosispora. Salah satu anggota Actinomycetes yang pertama kali diteliti adalah Salinispora.

II. PEMBAHASAN PENELITIAN
Penelitian yang sekarang ini didasarkan pada penelitian produk fermentasi tertentu dari Actinomycetes laut galur CNB 392 dan CNB 476 yang efektif menghambat hiperproliferatif sel mamalia. Galur CNB 392 dan CN B476 termasuk dalam suku Micromonosporaceae dan julukan Salinospora telah diusulkan untuk kelompok obligat laut ini. Produk reaksi yang dihasilkan oleh galur ini dikelompokkan sebagai salinosporamid dan sangat menguntungkan dalam mengobati kelainan neoplastik karena berat molekulnya yang rendah, nilai IC50 rendah, potensi pengobatan tinggi dan selektivitas untuk sel-sel kanker lebih tinggi daripada jamur

Dalam salah satu perwujudan penelitian, ada senyawa yang memiliki struktur (I)

Yang mana :
R1 ke R3 masing-masing bebas-H, alkil, menggantikan alkil, alkenil, menggantikan alkenil, alkinil, menggantikan alkinil, aril, menggantikan aril, heteroaril, menggantikan heteroaril, heterosiklik, menggantikan heterosiklik, sikloalkil, menggantikan sikloalkil, alkoksi, hidroksi, halogen , amino, amido, karboksil, -C (O) H, asil, oksiacil, karbamat, sulfonil, sulfonamide atau sulfuril; R4 bebas alkil, menggantikan alkil, alkenil, menggantikan alkenil, alkinil, menggantikan alkinil, aril, menggantikan aril, sikloalkil, menggantikan sikloalkil; E1 ke E4 masing-masing bebas-O, -NR5, atau –S dimana R5 adalah –H atau alkil C1-C6 dan x adalah 1 sampai 8.
Dalam perwujudan penelitian lebih lanjut, ada senyawa yang memiliki struktur (II)

Yang mana:
R1 ke R3 masing-masing bebas-H, alkil, menggantikan alkil, alkenil, menggantikan alkenil, alkinil, menggantikan alkinil, aril, menggantikan aril, heteroaril, menggantikan heteroaril, heterosiklik, menggantikan heterosiklik, sikloalkil, menggantikan sikloalkil, alkoksi, hidroksi, halogen , amino, amido,
karboksil,-C (O) H, asil, oksiacil, karbamat, sulfonil, sulfonamide atau sulfuril; R4 bebas alkil, menggantikan alkil, alkenil, menggantikan alkenil, alkinil, menggantikan alkinil, aril, menggantikan aril, sikloalkil, menggantikan sikloalkil; E1 ke E4 masing-masing bebas-O, -NR5, atau –S dimana R5 adalah –H atau alkil C1-C6 dan x adalah 1 sampai 8.
Dalam perwujudan lain dari penelitian, ada senyawa yang memiliki struktur (III)

Yang mana:
R1 ke R3 masing-masing bebas-H, alkil, menggantikan alkil, alkenil, menggantikan alkenil, alkinil, menggantikan alkinil, aril, menggantikan aril, heteroaril, menggantikan heteroaril, heterosiklik, menggantikan heterosiklik, sikloalkil, menggantikan sikloalkil, alkoksi, hidroksi, halogen , amino, amido, karboksil,-C (O) H, asil, oksiacil, karbamat, sulfonil, sulfonamide atau sulfuril; R4 bebas alkil, menggantikan alkil, alkenil, menggantikan alkenil, alkinil, menggantikan alkinil, aril, menggantikan aril, sikloalkil, menggantikan sikloalkil; E1 ke E4 masing-masing bebas-O, -NR5, atau –S dimana R5 adalah –H atau alkil C1-C6 dan x adalah 1 sampai 8.
Dalam perwujudan yang masih lebih lanjut dari penelitian, ada senyawa yang memiliki struktur (IV)


Dalam perwujudan lebih lanjut dari penelitian, ada senyawa yang memiliki struktur (V)

Dalam perwujudan lebih lanjut dari penelitian, ada senyawa yang memiliki struktur (VI)


Dari penelitian tersebut ada komposisi pengobatan yang termasuk salah satu senyawa yang memiliki struktur I-VI yang dapat diterima.
Terdapat artikel mengenai pembuatan termasuk bahan kemasan dan komposisi obat yang terkandung dalam bahan kemasan, di mana bahan kemasan yang terdapat di label yang menunjukkan komposisi dapat digunakan untuk pengobatan gangguan proliferatif sel dan di komposisi tersebut mencakup setidaknya ada satu senyawa berstruktur I-VI.
Metode untuk mengobati gangguan proliferatif sel mamalia. Misalnya dengan pemberian ke subjek yang membutuhkan terapi lebih efektif daripada jumlah



senyawa yang memilki struktur I-VI. Selain itu ada juga metode untuk menghasilkan senyawa struktur I-VI yang memiliki kemampuan untuk menghambat perkembangan hiperproliferatif sel-sel mamalia. Metode seperti ini dapat dilakukan, misalnya dengan menumbuhkan kultur dari Salinospora sp. strain CNB392 atau CNB476 dan mengisolasi dari kultur setidaknya satu senyawa struktur I.
Senyawa dalam penemuan tersebut mungkin dapat diformulasikan dalam komposis kefarmasian baik dalam bentuk garam. Produk farmasi dapat diterima dengan bentuk garam yang tidak toksik termasuk dengan penambahan garam basa (dengan bentuk karboksil bebas atau kelompok anionik lainnya.) yang mungkin berasal dari basa anorganik seperti, misalnya, natrium, kalium, amonium, kalsium, atau besi hidroksida, dan basa organik seperti sebagai isopropylamine, trimetilamina, 2-ethylamino-etanol, histidin, prokain, dan sejenisnya. Garam seperti itu mungkin juga diformulasikan sebagai tambahan garam asam dengan kelompok kationik bebas dan umumnya akan dibentuk dengan asam anorganik seperti, misalnya, klorida, sulfat, atau asam fosfat, atau asam organik seperti asetat, p-toluenasulfonat, methanesulfonic asam, oksalat, tartarat, mandelic, dan sejenisnya.
Garam dari penemuan tersebut juga termasuk garam amina yang dibentuk oleh protonasi dari kelompok amino dengan asam anorganik seperti asam klorida, asam bromida, asam iodida, asam sulfat, asam fosfat, dan sejenisnya.Garam dari penemuan tersebut juga termasuk garam amina yang dibentuk oleh protonasi dari grup amino dengan asam organik yang sesuai, seperti p-toluenasulfonat asam, asam asetat, dan sejenisnya.Eksipien tambahan yang dimaksud yang digunakan dalam praktek penemuan masa kini adalah mereka yang tersedia dalam sebuah suber autentik, misalnya, yang ditemukan di Amerika Serikat Pharmacopeia Vol.XII dan National Formulary Vol.XXII dan National Formulary Vol. XVII, US Pharmacopeia Konvensi, Inc, Rockville, Md (1989).
Senyawa dalam penemuan ini mungkin juga mengandung satu atau lebih atom karbon asimetris dan dengan demikian terjadi akibat campuran racemates dan racemic, satu enantiomer, campuran diastereomeric dan diastereomers tunggal. Istilah "stereoisomer" adalah senyawa kimia yang berbeda satu sama lain hanya dalam jalan perbedaan grup dalam molekul yang berorientasi dalam ruang. Stereoisomer memiliki bobot molekul yang sama, komposisi kimia, dan konstitusi lainnya , tetapi berbeda dengan grup atom yang ada. yaitu, perpecahan kimia yang berada pada orientasi yang berbeda dalam ruang oleh karena itu, ketika murni,


memiliki kemampuan untuk memutar bidang cahaya terpolarisasi. Namun, beberapa stereoisomer murni mungkin memiliki perputaran optik cukup sedikit bahwa hal itu tidak terdeteksi dengan penampakan instrumentasi.Semua bentuk isomerik seperti senyawa ini secara pasti dimasukkan dalam penemuan saat ini

III. ISOLASI
Pemurnian dengan HPLC dari penemuan senyawa diselesaikan dengan RP-MPLC pada fase diam C 18 (Aldrich) menggunakan gradien tahap kolom kontes flex (15x7 mm). HPLC semipreparatif dilakukan dengan sistem HPLC isokratik dengan pompa air 6000 H pada kolom fase normal Si-dynamas-60 A(250x5 mm) atau kolom reversed phase C18-dynamax 60 A, dengan aliran 2 ml/ menit dengan detektor air R401 refractomer yang berbeda
LC-MS kromatografi dilakukan pada sistem Hawlett Packard seri HP 1100 dengan deteksi DAD dan MSD 1100. Pemisahan diakhiri dengan fase terbalik C 18 (agilent hypersil ODS 5 µm, kolom dimensi 4,6x100 mm), kec. alir 0,7 ml/ menit menggunakan gradien standar : 10% asetonitril, 15 menit; 98% asetonitril (solven kemurnian tinggi Burdick dan Jackson). Deteksi MS dengan ESI positif-mode, tegangan kapiler 3500 eV, tegangan fragmentasi 70 eV, kisaran massa m/z 100-1000. Modus APCI diukur pada kec alir 0,5 mL/ menit, deteksi positif, tegangan kapiler 3000 eV, tegangan fragmentasi 70 eV.
Spektra-spektra NMR diukur pada spektrometer gradien-field varian 300 MHz dengan inverse-mode untuk spektra 1H atau 2D-NMR. Spektra 13 C dan spektra DEPT diukur pada varian 400MHz, yaitu sebuah instrument broadband. Sebagai penunjuk adalah standar internal tetrametil silan (TMS, 0.00 ppm)
Spektra MS-El dengan resolusi rendah MS-El dilakukan pada spektrometer massa sistem hawlett packcard dengan peralatan sektor magnetik, rata-rata pemanasan 200c/ menit sampai 3200c dengan inlet injeksi.
Data MS resolusi tinggi FTMS-MALDI didaptkan dengan operasi MALDI mode on Ionspec Ultima FT spektromter massa. Spektra IR diukur pada spektrometer IR perkin-Elmer FT menggunakan jeendela NaCl.

Isolasi dan karakterisasi spesies Salinospora, kultur no CNB 392 dan CNB 476
CNB 392 dan CNB 476 memiliki nukleotida penanda didalam rDNA 16S yang memisahkan strain ini secara filogenetik dari family Micromonosporaceae. Nukleotida penanda ini telah ditentukan sebagai marker definiif untuk anggota grup ini yang juga memiliki kebutuhan pertumbuhan secara fisiologis terhadap natrium. Nukelotida penanda diluruskan dengan posisi E. coli 27-1492 menggunakan semua anggota yang ada dari micromonosporaceae pada Ribosomal database project pada 31 januari 2001. Pada genus salinospora , 45 bagian sekuen morfotipe menunjukkan semua nukelotida penanda dari posisi 207-468. Tujuh salinospora mengisolasi kebanyakan sekuen pada keseluruhan (lihat gambar 2) menunjukkan semua penanda pada gambar 17
Strain CNB 392 dan CNB 476 membentuk warna orange menyala pada koloni hitam pada agar dan mycelia yang kekurangan udara. Pigmen coklat tua dan orange terang dihasilkan tergantung tahap pertumbuhan sel. Spora menggelapkan permukaan koloni dan tahap terhadap substrat micelia. Mycelia berkembangbiak secara vegetatif dengan cara tunas bukan fragmentasi.Spora diproduksi secara tunggal ataupun kelompok. Baik sporangia maupun motilitas spora belum diteliti pada strain ini. CNB 392 dan CNB 476 mempunyai kebutuhan pertumbuhan obligat untuk sodium dan tidak akan tumbuh pada media yang digunakan untuk menumbuhkan anggota generik yang lain dari micromonosporaceae. CNB 392 dan CNB 476 telah ditemukan tumbuh optimal pada media padar TCG pada suhu 300C.

A. Fermentasi
CNB392 dan CNB476 dikultur dalam media cair AlBfe+C atau CKA, sebanyak 1 liter media pada suhu 35°C, selama 9 hari. Setelah 4 hari, tambahkan 20 gram resin Amberlite XAD-16 (Sigma, nonionic polymeric adsorbent).

B. Ekstraksi
Resin XAD-16 disaring dan fraksi organic dielusi dengan 1 liter etil asetat dilanjutkan dengan 1 liter methanol. Filtrat kemudian diekstraksi dengan etil asetat (3x200 mL). Ekstrak kasar yang dihasilkan dari adsorpsi XAD adalah 105 mg. Sitotoksisitas pada HCT-assay sel kanker usus besar manusia adalah IC50<0,076 μg/mL.

C. Isolasi Salinosporamide A dari CNB392
Ekstrak kasar kemudian dianalisis menggunakan kromatografi fase terbalik dengan fase diam C18, serta menggunakan gradient elusi. HCT-116 assay menghasilkan 2 fraksi aktif, yaitu CNB392-5 dan CNB392-6. Kombinasi dari 2 fraksi aktif (51,7 mg) dianalisis menggunakan RP-HPLC dengan eluen methanol 85% dialirkan 2 mL/menit dan menggunakan refractive index detection. Fraksi aktif CNB392-5/6 kemudian dimurnikan dengan normal phase HPLC. Digunakan fase diam silika gel dan fase gerak etil asetat-isooktana (9:1) dengan kecepatan alir 2 mL/menit. Salinosporamide A diisolasi sebagai suatu padatan amorf tak berwarna sebesar 6,7 mg/liter (6,4%). TLC dengan fase diam silika gel dan fase gerak diklormetana-metanol (9:1) menunjukkan hasil Salinosporamide A berada pada Rf 0,6, tidak tampak

pada sinar UV, berwarna kuning dengan H2SO4/etanol, merah-coklat gelap dengan pereaksi Godin (Vanilin, H2SO4, HclO4). Salinosporamide A larut dalam CHCl3, metanol, dan pelarut polar lain seperti DMSO, aseton, asetonitril, benzene, piridin, N, N-dimethylformamide.

D. Uji Bioaktivitas
Salinosporamide A menunjukkan aktivitas yang kuat melawan sel kanker usus besar manusia dengan IC50 (0,011 μg/mL). Skrining untuk mengetahui aktivitas antibacterial atau antifungi menunjukkan aktivitas yang tidak berbeda secara signifikan (lihat keterangan berikut).


IV. DAFTAR PUSTAKA
Ahn, Kwang Seok,dkk,2007, Salinosporamide A (NPI-0052) potentiates apoptosis, suppresses osteoclastogenesis, and inhibits invasion through down-modulation of NF- B–regulated gene products, Blood 1 October 2007, Vol. 110, No. 7, pp. 2286-2295.
Eustaquio, Alessandra S,dkk, Biosynthesis of the salinosporamide A polyketide synthase substrate chloroethylmalonyl-coenzyme A from S-adenosyl-l-methionine. Diakses tanggal 11 november 2009
Jensen, Paul R,dkk,2007,Species-Specific Secondary Metabolite Production in Marine Actinomycetes of the Genus Salinispora, Applied and Environmental Microbiology, feb. 2007, p. 1146–1152
Lam, S Kim, Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes, Science direct, diakses tanggal 11 november 2009.