Kultur Akar Berambut 2

DEFINISI
Kultur akar merupakan kultur jaringan akar yang hidup dan berdiferensiasi secara terorganisir membentuk biomasa akar tanpa kehadiran tipe organ lain dari tanaman seperti batang, tunas atau daun secara in vitro (Payne et al. 1992).
Akar rambut adalah akar kecil berbentuk seperti rambut halus. Kultur akar rambut adalah suatu metode budidaya akar rambut secara in vitro dengan kondisi yang terkendali dan aseptis.
Akar yang dikulturkan dapat berupa akar normal atau akar transgenik hasil transformasi genetik.
1. Kultur akar normal diperoleh dengan menanam ujung akar tanaman atau kecambah secara in vitro dalam media yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman (ZPT).
2. Kultur akar transgenik diperoleh dengan menanam akar rambut (hairy root) yang dihasilkan dari transformasi genetik dengan bantuan bakteri tanah Agrobacterium rhizogenes. Transformasi genetik dengan Agrobacterium rhizogenes diketahui dapat menginduksi pembentukan akar rambut akibat proses transfer T-DNA dari Ri- (root inducing) plasmid ke genom tanaman (dalam sel) (Payne et al. 1992; Nillsson & Olson 1997 sit Sukma Dewi,2004) melalui pelukaan. T- DNA akan mengekspresikan gen-gen untuk mensintesis senyawa opin dan mengandung onkogen yang berperan untuk menyandi hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin.

KEGUNAAN
Kultur akar berambut digunakan untuk mengantisipasi ketidakmampuan kultur sel menghasilkan metabolit sekunder karena sel belum berdiferensiasi. Teknik merupakan metode yang ideal untuk mempelajari kandungan senyawa aktif yang diproduksi tanaman karena akar rambut dapat melakukan sintesis senyawa aktif yang diinginkan dan dapat tumbuh stabil dalam media in vitro (Savary & Flores 1994; Toppi et al. 1996). Kultur akar rambut tersebut telah digunakan untuk mempelajari keberadaan senyawa bioaktif seperti ribosome inactivating protein (RIP) atau senyawa bioaktif lainnya (alkaloida, flavonoida, poliaetilena dan fitoaleksin) (Toppi et al. 1996; Savary & Flores 1994).

KAITAN KULTUR AKAR BERAMBUT DENGAN METABOLIT SEKUNDER
Kultur akar berambut merupakan perkembangan dari kultur akar yang menjanjikan. Hal ini disebabkan kultur akar berambut dapat meningkatkan produksi metabolit sekunder menggunakan elisitasi.



METODE PELAKSANAAN
1. pemilihan eksplan
2. eksplan dicuci kemudian disterilkan dengan sterilan, kemudian dibilas dengan air steril selanjutnyaditumbuhkan dalam media padat yang sesuai.
3. eksplan yang dipilih kemudian dikecambahkan dalam media padat selama waktu yang ditentukan
4. inokulasi bakteri
Agrobacterium rhizogenes ( biasanya strain LBA 9457) ditumbuhkan dalam media yeast manitol broth (YMB) padat yang tersusun dari yeast extract (0.4 g/l), manitol (10 g/l), NaCl (0.1 g/l),MgSO4 7H2O (0.2 g/l), KH2PO4 (0.5 g/l) dan agar-agar (7 g/l) sebagai bahan pemadat. Media YMB padat yang digunakan diatur dengan pH 7.0 Sebelum diautoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1.5 psi selama 20 menit. Induksi pembentukan akar rambut dilakukan dengan cara menusukkan jarum preparat yang telah dicelupkan ke koloni bakteri umur 3 hari ke bagian hipokotil dari eksplan.
Pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang diinfeksi Agrobacterium diamati selama 21 hari. Induksi yang dilakukan menyebabkan infeksi dan menghasilkan akar berambut. Morfologi akar rambut yang terbentuk bervariasi dari yang tebal, kaku, dan pendek atau langsing dan memanjang. Akar rambut yang muncul dari hipokotil maupun dari bagian kecambah yang lain diisolasi dan ditanam dalam media MS padat tanpa penambahan ZPT (MS-0) yang mengandung antibiotika. Antibiotika ditambahkan dalam media untuk mematikan Agrobacterium yang tersisa. Akar rambut yang tumbuh disubkultur ke dalam media dengan antibiotika yang masih segar setiap 14 hari dan subkultur dilakukan sampai tiga kali. Setelah tiga kali subkultur, akar rambut yang berhasil tumbuh dengan baik dalam media MS-0 padat tersebut selanjutnya dipindahkan ke media MS-0 cair tanpa antibiotik, diinkubasikan diatas pengocok (shaker) dengan kecepatan putaran 100 rpm, dan diletakkan dalam ruang kultur yang diatur pencahayaannya (1000 lux) selama 12 jam, dengan suhu ruangan rata-ratanya antara 25 –27°C.








HASIL

Selain akar rambut yang berkembang dari jaringan yang diinfeksi oleh Agrobacterium, sejumlah akar rambut yang tumbuh dari bagian yang tidak diinokulasi juga diisolasi dan ditanam dalam media MS-0 yang mengandung antibiotik. Hasil pengamatan menunjukkan akar rambut yang berkembang dari bagian yang diinfeksi Agrobacterium mampu tumbuh dengan baik dalam medium MS-0. Sebaliknya, akar rambut yang diisolasi dari bagian kecambah yang lain tidak mampu berkembang dan mati dalam media MS-0.
Frekuensi didapatkannya galur akar rambut yang dapat tumbuh dalam media tanpa ZPT dalam penelitian ini relatif sangat rendah. Hal ini sebagian disebabkan salah satunya oleh kesulitan dalam mematikan kontaminan Agrobacterium setelah proses transformasi genetik selesai dilakukan. Kesulitan dalam menghilangkan kontaminan Agrobacterium telah dilaporkan sebagai salah satu kendala utama dalam meningkatkan frekuensi hasil transformasi genetik dengan bantuan Agrobacterium (Shackelford & Chlan 1996). Namun demikian tidak tertutup kemungkinan adanya berbagai faktor lain yang menyebabkan rendahnya frekuensi transformasi mengingat transfer T-DNA dari Agrobacterium ke tanaman merupakan proses yang kompleks dan dipengaruhi oleh berbagai faktor dari sisi tanaman dan dari sisi Agrobacterium (Gelvin 2000).

FAKTOR-FAKTOR YANG BERPENGARUH PADA KULTUR AKAR BERAMBUT :
- Galur bakteri
- Spesies tanaman yang akan dikultur
- Bagian eksplan yang akan digunakan
- Komposisi media
- Inisiasi meliputi pertumbuhan, perkembangan, dan figure kultur.




KELEBIHAN
1. Akar rambut dapat meningkatkan produksi dan kapasitas metabolit sekunder. Manipulasi yang dapat dilakukan antara lain seleksi galur akar rambut yang produktif, optimasi kondisi media kultur dan induksi produksi senyawa aktif dengan perlakuan elisitasi (Fu 1999).
2. Regenarasi dan kestabilan genetik yang tinggi
3. Dapat menggunakan medium tanpa penambahan zat pengatur tumbuh.

KERUGIAN KULTUR AKAR BERAMBUT :
1. Tidak semua metabolit sekunder yang diinginkan dihasilkan oleh kultur akar berambut karena hasil metabolit sekunder dari kultur tersebut tidak dapat dipastikan.
2. Scalling up dengan bioreactor terlalu rumit.

KESIMPULAN
Dari beberapa kelebihan kultur akar berambut dapat digunakan untuk meningkatkan produksi metabolit sekunder pada tanaman. Salah satunya adalah kestabilan genetik dan mudah dimanipulasi untuk peningkatan produktivitasnya. Manipulasi ini bisa dalam bentuk elisitasi dsb.

DAFTAR PUSTAKA
Fu TJ. 1999. Plant cell and tissue culture for food ingredient production. Di dalam: Fu TJ,
Sing G, Curtis WR (ed.) Plant Cell and Tissue Culture for the Production of Food
Ingredient. New York:Kluwer Academic/Plenum Publishers. hlm 1- 6
Gelvin SB. 2000 Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and
integration. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51:223-256.
Nilsson O, Olsson O. 1997. Getting to the root: the role of the Agrobacterium rhizogenes
rol genes in the formation of hairy roots. Physiol Plant 100:463-473.
Payne GF, Bringi V, Prince CL,Shuler ML. 1992. Plant Cell and Tissue Culture in Liquid
Systems. New York: John Wiley and Sons.
Savary BJ, Flores HE. 1994. Biosynthesis of defense-related protein in transformed root
cultures of Trichosanthes kirilowii Maxim var. Japonicum (Kitam). Plant Physiol
106:1195-1204.
Shackelford NJ, Chlan CA. 1996. Identification of antibiotics that are effective in
eliminating Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol Rep 14(1):50-57.
Sukma, Dewi. 2004, Karakter Pertumbuhan Akar Rambut (Hairy Root) dari Paria Belut (Trichosanthes cucumerina var. Anguina ) pada Perlakuan Sukrosa dan Kasein Hidrosilat dalam Media Kultur Jaringan, Sekolah Pasca sarjana IPB, Bogor

Toppi LSD, Gorini P, Properzi G, Barbieri L, Spano L. 1996. Production of ribosomeinactivating
protein from hairy root cultures of Luffa cyllindrica (L) Roem. Plant
Cell Reports 15:910-913