Kamis, 14 Januari 2010

kultur akar berambut

Pada dekade terakhir ini, perhatian memproduksi metabolit sekunder beralih pada pemanfaatan teknologi kultur akar rambut. Karena adanya penelitian pada awal tahun 1980an yang menyebutkan bahwa akar di beberapa spesies terbentuk dari Agrobacterium rhizogenes yg bisa tumbuh dengan cepat tanpa membutuhkan fitohormon eksogen (Tepfer dan Tempe, 1981. Willmitzer et al, 1982).

Definisi
Akar berambut adalah anak akar yang berupa akar kecil berbentuk seperti rambut halus. Sedangkan yang dimaksud dengan kultur akar berambut adalah suatu metode budidaya akar berambut secara in vitro dengan kondisi yang terkendali dan aseptis.
Kultur akar merupakan kultur jaringan akar yang hidup dan berdiferensiasi secara terorganisir membentuk biomasa akar tanpa kehadiran tipe organ lain dari tanaman seperti batang, tunas atau daun secara in vitro (Payne et al. 1992). Akar yang dikulturkan dapat berupa akar normal atau akar transgenik hasil transformasi genetik. Kultur akar normal diperoleh dengan menanam ujung akar tanaman atau kecambah secara in vitro dalam media yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman. Sedangkan kultur akar transgenik diperoleh dengan menanam akar rambut (hairy root) yang dihasilkan dari transformasi genetik dengan bantuan Agrobacterium rhizogenes.

Gambar 1. Kultur Akar Berambut

Kegunaan
Kultur akar berambut merupakan kultur organ pada teknik kultur jaringan tanaman yang utamanya digunakan untuk memproduksi metabolit sekunder.

Kaitan Kultur Akar Berambut dengan Metabolit Sekunder
Kultur akar berambut yang telah dilakukan yaitu kultur dari akar yang merupakan hasil transformasi sel tanaman dengan Agrobacterium rhizogenes. Agrobacterium merupakan bakteri tanah yang mempunyai kemampuan untuk mentransfer T-DNA dari plasmid yang dikenal dengan Ri plasmid (root inducing plasmid) ke dalam sel tanaman melalui pelukaan (Nilson & Olsson, 1997).
Prosesnya adalah sebagai berikut, T-DNA akan terintegrasi pada kromosom tanaman dan akan mengekspresikan gen-gen untuk mensintesis senyawa opine, di samping itu T-DNA juga mengandung onkogen yaitu gen-gen yang berperan untuk menyandi hormon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Ekspresi onkogen pada plasmid Ri mencirikan pembentukan akar adventif secara besar-besaran pada tempat yang diinfeksi dan dikenal dengan ‘hairy root’ (Nilson & Olsson, 1997).
Penyerangan terhadap akar oleh bakteri Agrobacterium rhizogenes yang menyebabkan tumbuhnya akar berambut secara cepat pada eksplan. akan dapat menghasilkan metabolit sekunder.
Kultur akar rambut tersebut telah digunakan untuk mempelajari keberadaan senyawa bioaktif seperti ribosome inactivating protein (RIP) atau senyawa bioaktif lainnya (alkaloida, flavonoida, poliaetilena dan fitoaleksin) (Toppi et al. 1996; Savary & Flores 1994). Akar rambut dari L. cylindrical dilaporkan memproduksi RIP yang diberi nama luffin dengan kuantitas dan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang diproduksi oleh bagian tanaman lainnya (Toppi et al. 1996).

Aplikasi Kultur Akar Berambut
Teknik ini merupakan suatu pilihan kultur organ yang digunakan ketika metabolit sekunder tidak dapat dihasilkan oleh sel. Metabolit sekunder umumnya muncul saat sel telah terdiferensiasi.

Metode
1. Pemilihan eksplan
2. Eksplan dicuci lalu disterilkan dengan sterilan, kemudian dibilas dengan air steril selanjutnya ditumbuhkan dalam media padat yang sesuai.
3. Eksplan yang dipilih kemudian dikecambahkan dalam media padat selama waktu yang ditentukan.
4. Inokulasi bakteri
Agrobacterium rhizogenes strain LBA9457 ditumbuhkan dalam media yeast manitol broth (YMB) padat yang tersusun dari yeast extract (0,4 g/l), manitol (10 g/l), NaCl (0,1 g/l), MgSO4.7H2O (0,2 g/l), KH2PO4 (0,5 g/l), dan agar-agar (7 g/l) sebagai bahan pemadat. Induksi pembentukan akar rambut dilakukan dengan cara menusukkan jarum preparat yang telah dicelupkan ke koloni bakteri umur 3 hari ke bagian hipokotil dari eksplan.

Contoh penelitian dalam teknik kultur akar berambut adalah eksplan batang dan daun berasal dari kecambah aksenik C. ledgeriana dan C. succirubra berumur 8 bulan diinokulasi dengan A. rhizogenes galur 15834, 8196, R-20001, 07-20001, A4, R.MAFFA,TISTR 509, TISTR 510 dan LBA 9457. Eksplan yang sudah diinokulasi dikulturkan dalam medium MS padat. Subkultur dilakukan dengan cara mentransfer potongan ujung akar rambut ke dalam medium cair MS, B5, White dan Heller. Akar rambut dari medium kultur yang terbaik kemudian disubkultur ke dalam medium yang sama dengan penambahan 50 dan 100 mg/L L-triptofan dengan konsentrasi vitamin sebanyak tiga kali dan lima kali dari konsentrasi normal MS. Integrasi TDNA dalam akar rambut dikonfirmasi menggunakan Polymerase Chain Reaction dengan primer spesifik untuk TL dan TR-DNA plasmid. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa hanya A.rhizogenes galur LB9457 yang efektif menginfeksi eksplan baik batang maupun daun dari kedua spesies kina. Induksi, pertumbuhan dan vigor akar rambut yang terbaik diperoleh dari medium MS dengan penambahan 50 mg/L L-triptofan dan tiga kali konsentrasi vitamin. Hasil konfirmasi akar rambut baik dari batang maupun daun menggunakan PCR, menunjukkan bahwa TL dan TR-DNA dari Ri plasmid A. rhizogenes mampu menghasilkan pita-pita DNA dengan BM780 dan 1600 pb. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa (Mathius, dkk, 2006).

Hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan kultur akar berambut antara lain:
1. Galur Agrobacterium rhizogenes
2. spesies tanaman
3. sumber eksplan dan
4. komposisi medium
Keempatnya berpengaruh terhadap inisiasi, pertumbuhan, perkembangan dan vigor akar rambut

Keuntungan Kultur Akar Berambut:
1. Hasilnya yang relatif seragam
2. Memiliki kestabilan genetik yang tinggi.
3. Mudah dilakukan elisitasi untuk peningkatan jumlah produksi metabolit sekunder.
4. Kapasitas metabolit sekunder lebih besar daripada tanaman asal.
5. Merupakan metode yang ideal untuk mempelajari kandungan senyawa aktif yang diproduksi tanaman karena akar rambut dapat melakukan sintesis senyawa aktif yang diinginkan dan dapat tumbuh stabil dalam media in vitro
6. Prosesnya yang relatif mudah yaitu penggunaan media untuk tumbuh tidak memerlukan penambahan zat pengatur tumbuh.
7. Mudah untuk memanipulasi berbagai faktor dalam kultur jaringan yang digunakan dengan tujuan untuk meningkatkan produksi biomasa atau senyawa aktif yang diinginkan. Manipulasi yang dapat dilakukan antara lain seleksi galur akar rambut yang produktif, optimasi kondisi media kultur dan induksi produksi senyawa aktif dengan perlakuan elisitasi (Fu 1999).
8. Kultur akar ini bisa di regenerasi. sedangkan pada kultur sel, viabilitas sel dapat hilang dengan beberapa kali subkultur.
Kerugian Kultur Akar Berambut:
1. Pembentukan akar berambut tidaklah mudah karena keberhasilan transformasinya rendah.
2. Tidak semua yang dihasilkan oleh kultur akar berambut adalah metabolit sekunder yang kita inginkan, sehingga hasil metabolit sekunder dari kultur akar berambut tidak dapat dipastikan.
3. Rendahnya tingkat keberhasilan transformasi eksplan dengan Agrobacterium rhizogenes dan pertumbuhannya yang lambat
4. Sulitnya scaling-up dengan rancang bangun bioreaktor.

Untuk meningkatkan produktivitas kultur akar berambut ini dapat dilakukan salah satunya adalah dengan cara elisitasi menggunakan elisitor pada sel tumbuhan dengan tujuan untuk menginduksi dan meningkatkan pembentukan metabolit sekunder.


DAFTAR PUSTAKA
Mathius, N.T, dkk, 2006, Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin dari akar rambut tanaman kina (Cinchona succirubra Pavon ex Klotzsch). Menara Perkebunan, 74 (1), 10-22
Mathius, N.T, dkk, 2006, Hairy Root Culture Of Cinchona ledgeriana and C. Succirubra By In Vitro Culture. [Tersedia online], diakses tanggal 2 Desember 2009, pukul 17.00
Mathius, N.T, dkk, 2006, Hairy root culture in vitro and the application of dual culture for growth and development of endomycorrhiza ( Gigaspora sp. and Acaulospora sp.). [Tersedia online], diakses tanggal 2 Desember 2009, pukul 17.00
Nilsson O, Olsson O, 1997, Getting to the root: the role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots, Physiol Plant 100:463-473
Payne GF, Bringi V, Prince CL,Shuler ML, 1992, Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems, John Wiley and Sons, New York
Savary BJ, Flores HE,1994, Biosynthesis of defense-related protein in transformed root cultures of Trichosanthes kirilowii Maxim var. Japonicum (Kitam), Plant Physiol 106:11
Toppi LSD, Gorini P, Properzi G, Barbieri L, Spano L. 1996, Production of ribosomeinactivating protein from hairy root cultures of Luffa cyllindrica (L) Roem, Plant Cell Reports 15:910-913.
Srivastava, S., Srivastava, A. K., 2007, Hairy Root Culture for Mass Production of High-Value Secondary Metabolites, Critical Reviews in Biotechnology 27: 29-43.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar

ayo tulis komentar donk