Biosintesis Nukleotida

 Biosintesis Nukleotida
Nukleotida ini memerankan peran kunci dalam hampir semua peristiwa biokimia :
1. Merupakan prekursor aktif untuk DNA & RNA
2. Derivat nukleotida merupakan zat antara aktif pada banyak proses biosintesis. Misalnya, UDP-Glukosa dan CDP-Diasilgliserol merupakan prekursor glikogen dan fosfogliserida. S-Adenosil metionin membawa gugus metil aktif.
3. ATP yaitu suatu nukletida adenin, adalah suatu penukar energi yang universal pada sistem biologiGTP merupakan sumber energi pada banyak jenis gerakan makromolekul seperti translokasi rantai peptida Nasens pada ribosom dan pengaktifan protein yang terangkai dengan sinyal.
4. Nukleotida adenin mempunyai komponen 3 macam koenzim terpenting : NAD+, FAD dan KoA.
5. Nukelotidajuga berperan sebagai regulator metabolik. AMP siklik, yang tersebar luas merupakan mediator pada kerja berbagai hormon. Modifikasi kovalen pada ATP mengubah aktivitas berbagai enzim seperti pada fosforilasi Glikogen sintase dan Glutamin sintetase.

 Nukleotida disintesis dari :
1. Unit-unit penyusun yang sederhana (Sintesis De Novo)
Purin dan Pirimidin dibentuk secara De Novo dari asam-asam amino, derivat tetrahidrofolat, NH4+ dan CO2.
2. Atau melalui pendauran ulang basa-basa yang sudah terbentuk (Sintesis Penyelamatan / Salvage)
Fragmen gula fosfor pada ribonukleotida berasal dari 5-fosforibosil-1-pirofosfat yang metupakan donor aktif. Deoksiribonukleotida disintesis melalui reduksi (dTMP) dibentuk pada metilasi dioksidasi uridilat (dUMP).
Akan kita lihat bagaimana berbagai nukleotida diolah dari unit-unit penyusun sederhana yang tertentu juga sama menariknya adalah sirkuit pengatur yang berliku-liku agar terjadi sintesis nukleotida-nukleotida utama yang sesuai keperluan.
Suatu pengertian mengenai metabolisme nukleotida juga berguna untuk memberikan pengertian mengenai proses penyakit dan pengobatannya. Analog-analog nukleotida merupakan obat penting pada pengobatan kanker, infeksi virus, penyakit otoimun, dan kelainan genetic seperti piral.











 Numenklatur Basa, Nukleosida, dan Nukleotida
Mungkin kita masih ingat bahwa Nukleosida terdiri dari basa purin atau pirimidin yang terikat pada suatu pentosa, sedangkan Nukleotida adalah ester fosfat dari nukleosida nama basa-basa terpenting RNA dan DNA beserta Nukleosida dan Nukleotida tertera pada Tabel 29.1
Tabel 29.1
Nomenklatur macam-macam basa, nukleosida dan nukleotida
Basa Ribonukleosida Ribonukleotida (5’-monofosfat)
Adenin (A)
Guanin (G)
Urasil (U)
Sitosin (C) Adenosin
Guanosin
Uridin
Sitidin Adenilat (AMP)
Guanilat (GMP)
Uridilat (UMP)
Sitidilat (CMP)
Basa Deoksiribonukleosida Deoksiribonukleotida (5’-monofosfat)
Adenin (A)
Guanin (G)
Timin (T)
Sitoain (C) Deoksiadenosin
Deoksiguanosin
Deoksitimidin
Deoksisitidin Deoksiadenilat (dAMP)
Deoksiguanilat (dGMP)
Deoksitimidilat (dTMP)
Deoksisitidilat (dCMP)


 Cincin Purin disintesis dari asam-asam amino, derivat tetrahidrofolat dan CO2
Kini kita mulai membicarakan sintesis Nukleotida Purin. Cincin Purin disusun De Novo dari berbagai prekursor yang sederhana. (Gambar 29-3)


Glisin memberikan atom-atom C-4, C-5, dan N-7. atom N-1 berasal dari aspartat. Kedua atom nitrogen lainnya, N-3 dan N-9, berasal dari gugus amida rantai samping glutamin. Derivat tetrahidrofolat yang aktif melengkapi dengan atom-atom C-2 dan C-8, sedangkan C-6 berasal dari CO2.

 PRPP merupakan donor unit ribosa pada biosintesis nukleotida
• Bagian ribosa fosfat pada nukleotida purin dan pirimidin berasal dari 5-fosforibosil-1-pirofosfat (PRPP) yang telah kita temui pada waktu membicarakan sintesis triptofan.
• PRPP disintesis dari ATP dan ribosa-5-fosfat, yang terutama disintesis melalui jalur pentosa fosfat.
• PRPP sintetase mengkatalis pemindahan gugus β-γ-pirofosforil dari ATP ke taom C-1 Ribosa 5-fosfat
• PRPP mempunyai konfigurasi α- pada C-1, yaitu atom karbon yang diaktifkan.


 Cincin Purin disusun pada Ribosa Fosfat
o Gugus amida yang berasal dari rantai samping glutamin menggantikan gugus pirofosfat yang menempel pada C-1 PRPP.
o Pada reaksi ini, konfigurasi C-1 diubah dari α ke β ikatan Glokosidik C-N yang dihasilkan mempunyai konfigurasi β yang merupakan ciri khas nukleotida yang terdapat di alam. Reaksi ini digerakkan oleh Hidrolisis Pirofosfat
o Langkah yang menentukan pada sintesis De Novo, Nukleotida purin ialah pembentukan 5-fosforibosil amin dari PRPP dan Glutamin.


 Glisin bergabung dengan fosforibosilamin untuk menghasilkan Glisin Amida Ribonukleotida (Gambar 29-5)


Satu ATP diperlukan untuk membentuk ikatan amida diantara gugud karboksil. Glisin dan gugus amino fosforibosilamin. Suatu zat antara asil fosfat dibentuk seperti pada biosintesis glutamin, glutation dan hampir semua ikatan amida lainnya.


 Tingkat kedua pada biosintesis purin adalah pembentukan inosinat dari ribonukleida 5-aminoimidazol. Pada dasarnya reaksi ini adalah (6) Karboksilasi (7) penambahan aspartat (8) Penambahan fumarat (tinggal gugus amino yang berasal dari dari aspartat), (9) Formilasi oelh N10-, Formiltetrahidrofolat dan (10) dehidrasi serta penutupan cincin. Enzim;enzim vertebrata yang mengkatalisis langkah 6 dan 7 terdapat pada satu rantai polipeptida, demikian juga yang mengkatalisis langkah 9 dan 10

 AMP dan GMP dihasilkan dari IMP
Inosinat merupakan produk jalur De Novo dan merupakan prekursor untuk AMP dan GMP (Gambar 29-7)


 Pola mekanisme sejenis pada masing-masing proses tersebut ialah koversi atom oksigen karbonil menjadi suatu derivat yang dapat dengan mudah digantikan oleh gugus amino. Bentuk tautomer gugus karbonil bereaksi dengan ATP (atau GTP) dan membentuk ester fosforil yang kemudian diserang secara nukleofilik oleh atom nitrogen (Gambar 29-8)


Fosfat inorganik kemudian dikeluarkan dari senyawa tetrahedral ini untuk menyudahi seluruh reaksi tersebut. Atom nitrogen yang menyerang dapat berasal dari NH3, gugus amida pada rantai samping Glutamin, atau gugus amino α-pada aspartat. Pada jenis reaksi seperti ini, gugus yang dibebaskan dapat berupa Pi, PPi, atau fragmen AMP. Pada reaksi yang serupa, PPi digantikan oleh gugus amino Glutamin pada sintesis 5-fosforibosil-1-amin dari PRPP.

Basa purin dapat didaur kembali melalui reaksi pwnyelamatan (salvage) yang menggunakan PRPP
Basa purin yang bebas dibentuk oleh pemecahan asam nukleat dan nukleotida secara hidrolitik. Nukleotida purin dapat disintesis dari basa yang sudah jadi ini melalui suatu reaksi penyelamatan (salvage yang lebih sederhana dan bebannya tidak sebesar reaksi-reaksi dijalur sintese de Novo yang telah diuraikan. Pada reaksi penyelatan fragmen ribose fosfat dipindahkan dari PRPP ke purin untuk menghasilkan ribonukleotida yang sesuai.
Reaksi


Dua enzim untuk penyelamatan dengan berbagai kespesifikan akan memulihkan basa purin, adenine fosfo ribosil transferase mengkatalisis pembentukan adenilat:
Adenine + PRPP  adenilat + PPi
Sedangkan hipoxantin-guanin fosforibosil transferase mengkatalis pembentukan inosinat dan guanilat.
Hipoxantin +PRPP  inosianat + PPi
Guanin + PRPP  guanilat + PPi
AMP, GMP, dan IMP merupakan inhibitor umpan balik biosintesis nukleotida purin
Biosintesi nukleotida purin dikendalikan oleh inhibisi umpan balik dan mekanisme pengatur lainnya pada beberapa tahap reaksi (gambar 29-9)

Gambar 29-9 Pengendalian biosintesis purin

1. 5-fosforibosil-1-pirofosfat dintetase, enzim yang mensintesis PRPP, sebagian dihambat oleh kadar nukleotida purin yang tinggi. PRPP juga merupakan precursor pirimidin dan histidin dengan demikian sintetase ini ada di bawah pengaruh inhibisi umpan balik kumulatif oleh senyawa-senyawa yang berasal dari berbagai jalur metabolisme.
2. Langkah yang menentukan pada biosontesis nukleotida purin adalah konversi PRPP menjadi fosforibosilamin oleh gutamin-PRPP-amidotransferase. Enzim kunci ini dihambat secara umpan balik oleh bermacam-macam ribonukleotida. Patut untuk disimak bahwa AMP dan GMP yang merupakan hasil akhir jalur itu, secara sinergi juga menghambat amidotransferase tadi.
3. Inosinat merupakan titik percabangan pada sintesis AMP dan GMP. Inhibisi umpan balik terjadi pada reaksi-reaksi sesudah inosinat. AMP menghambat perubahan inosinat menjadi adenilo suksinat, yaitu precursor yang langsung membentuk AMP. Dengan cara yang sama, GMP menghambat konversi inosinat menjadi xantilat, yaitu precursor langsungnya.
4. GTP merupakan substrat pada sintesis AMP, sedangkan ATP adalah substrat pada sintesis GMP. Penggunaan ATP dan GTP dalam hal ini cenderung untuk membuat seimbang ribonukleotida adenine dan guanine.
5. Pada Escherichia coli, kebanyakan gin penyendi enzim-enzim pada jalur de Novo diatur secara terkoordinasi diatur secara terkoordinasi. Transkripsinya dapat dihambat secara spesifik oleh repressor purin (PurR), yaitu suatu protein pengikat DNA apabila kadar hipoxantin dan Guanin berlebihan.


Cincin pirimidin disintesis dari karbamoil fosfat danaspartat
Sekarang kita beralih dari purin ke pirimidin. Cincin pirimidin Lebih dulu disusun dan kemudian dikaitkan pada ribosa fosfat untuk membentuk nukleotida pirimidin. Berbeda dengan reaksi-reaksi pada sintesis de Novo nukleotida purin. Prekursor cincin pirimidin adalah karbamoil fosfat dan aspartat (gambar 29-10)


Gambar 29-10
Sumber atom-atom cincin piridin. C-2 dan N-3 berasal dari karbamoil fosfat, sedangkan atom-atom lainnya pada cincin itu berasal dari aspartat

Biosintesis pirimidin dimulai dengan pembentukan karbamoil fosfat yang juga merupakan zat antara pada sintesis urea. Sintesis donor karbamoil altif ini berlangsung dalam ruangan-ruangan tertentu pada eukariot. Karbamoil fosfat untuk mensintesis pirimidin dibentuk disitosol, sedangkan untuk membuat urea dibentuk di mitokondria, oleh enzim karbamoil fosfat sintetase yang berbeda.
Perbedaan lain yang perlu diperhatikan ialah bahwa glutamin dan bukan NH4+ yang merupakan donor nitrogen pada sintesis karbamoil fosfat disitosol. Juga, pada sintesis disitosol N-asetil glutamat tidak berperan sebagai aktivator alosterik.

Glutamin + 2ATP +HCO3- karbamoil fosfat + 2 ADP + Pi +g lutamat

Langkah awal pada biosintesis pirimidin ialah pembentukan N-karbamoil aspartat pada aspartat dan karbamoil fosfat. Proses karbamoilisasi ini dikatalisis oleh aspartat transkarbamoilase, yang merupakan enzim pengatur yang sangat menarik.
(Reaksi)

Cincin pirimidin dibentuk pada reaksi berikutnya, yaitu pembentukan cincin karbamoil aspartat disertai kehilangan air untuk menghasilkan dihidroorotat. Demikian juga orotat dibentuk oleh dehidrogenasi dihidroorotat.
(Reaksi)



Orotat memperoleh fragmen ribosa fosfat dari PRPP untuk menghasilkan suatu nukleotida pirimidin.
Langkah berikut pada isntesis nukleotida pirimidin ialah pengikatan gugus ribosa fosfat. Seperti pada sintesis purin, donornya juga PRPP. Orotat (suatu pirimidin bebas)bereksi dengan PRPP membentuk orotidilat (suatu pirimidin). Reaksi ini yang dikatalis oleh orotat fosforibosil transferase ini di gerakkan oleh hidrolisis pirofosfat. Orotidilat kemudian mengalami dekarboksilasi menjadi uridilat (UMP) yang merupakan suatu nukleotida pirimidin utama.
(Reaksi)


Biosintesis pirimidin pada organisme ang lebih tinggi tingkatannya dikatalis oleh enzim-enzim multi fungsi.
o Pada e. Coli keenam enzim yang mensintesis UMP dari prekursor yang sederhana tampaknya tidak saling erikat. Pada eukariot ditemukan sebaliknya, yaitu lima diantaranya tergabung dalam dua kompleks.
o Salah satu dari enzim multi fungsi ini ditemukan ketika pada biakkan sel mamalia ditambahkan N-(Fosfonasetil)-L-Aspartat (PALA), yaitu suatu inhibitor aspartat transkarbamoilase (ATCase) yang ampuh. Ingat kembali bahwa PALA terikat kuat pada ATCase (KI=10Nm) oleh karena senyawa itu mempunyai bentuk transisi pada proses katalisis.


Sel-sel yang selamat mengatasi pengaruh hambatan PALA dengan membuat 100 kali lebih banyak ATCase dibandingkan dengan sel normal dan sangat diluar dugaan, kadar karbamoil fosfat sintetase dan dihidroorotase juga meningkat 100 kali lipat.


Sebaliknya, enzim-enzim yang mengkatalis langkah-langkah berikutnya pada biosintesis pirimidin tidak dipengaruhi oleh PALA. Kesimpulan dari hasil peringatan ini ialah bahwa karbamoil fosfat sintetase, Aspartat karbamoilase dan dihidroorotase disatukan secara kovalen menjadi rantai polipeptida tunggal 240 kd. Enzim multi fungsi ini disebut CAD.
(Reaksi N-fosfonasetil)-L-aspartat (PALA))


Antara Nukleotida Mono, Di-, dan Trifosfat dapat terjadi interkonvensi
Nukleotida bentuk aktif pada proses biosintesis dan konversi energi merupakan difosfat dan trifosfat. Nukleotida monofosfat diubah ke bentuk difosfat oleh enzim nukleosida monofosfat kinase yang spesifik, dengan ATP sebagai donor fosforil. Misalnya, UMP disfosforilasi oleh UMP kinase.

UMP + ATP  UDP + ADP

AMP, ADP, dan ATP dapat terlaksana oleh adenilat kinase. Tatapan keseimbangan reaksi intu sekitar 1

AMP + ATP  2 ADP

Interkonversi nukleosida difosfat dan trifosfat terlaksana oleh nukleosida difosfat kinase, suatu enzim yang mempunyai spesifotas yang luas, berbeda dengan enzim-enzim monofosfat kinase, pada persamaan reaksi berikut, X dan Y dapat merupakan salah satu dari bermacam-macam ribonukleosida atau dioksiribonukleosida.

XDP + YTP  XTP + YDP
UDP +ATP  UTP + ADP

CTP dibentuk melalui aminasi UTP
o Sitidin trifosfat (CTP) berasal dari uridin trifosfat (UTP) yang merupakan ribonukleotida terpenting lainnya. Atom oksigen karbonil pada C-4 digantikan oleh gugus amino pada mamalia gugus amida glutamin merupakan donor amino sedamgkan pada E.Coli NH4+ digunakan untuk reaksi itu. Mamalia mencegah peninggian kandungan NH4+ pada plasmanya dengan menghasilkan gugus amino secara insitu dari suatu donor seperti misalnya glutamin. ATP digunakan pada kedua reaksi aminasi itu. Seperti pada konversi inosinat menjadi AMP dan GMP, suatu zat antara berupa asil fosfat diserang secara nukleofilik oleh atom nitrogen.
(Reaksi)

Biosintesis nukleotida pirimidin pada bakteri diatur secara ing\hibisi umpan balik
o Langkah yang menentukan pada biosintesis nukleotida pirimidin pada E. Coli ialah pembentukan N-karbamoil aspartat dari aspartat dan karbamoil fosfat. Aspartat transkarbamoilase (ACTase), enzim yang mengkatalisis reaksi itu dihambat secara umpan balik oleh UMP (Gambar 29-12). Struktur dan mekanisme alosterik ACTase E.Coli telah dibahas di muka.
(gambar 29-12)

Gambar 29-12
Pengendalian biosintesis piridin pada E.Coli

Ribonukleotida Reduktase : suatu enzim radikal, mengkatalisis sintesis deoksiribonukleotida.
Sintesis deoksiribonukleotida. Prekursor-prekusor DNA ini dibentuk melalui reduksi Ribonukleotida. Gugus 2’-hidroksil pada fragmen ribosa diganti oleh atom H. Sebagai substrat adalah Ribonukleotida difosfat atau trifosfat, pereduksi terakhir adalah NADPH. Situs aktif yang sama juga bekerja pada keempat Ribonukleotida. Stokiometri keseluruhan ialah sebagai berikut :

Ribunukleosida difosfat Deoksiribosanukleosida difosfat

Mekanisme reaksi yang sebenarnya lebih rumit daripada yang diperlihatkan oleh persamaan reaksi diatas. Yang paling diketahui adalah sistem E. Coli yang hidup secara aerob.
• Peter Richard telah menunjukkan bahwa electron yang berasal dari NADPH diteruskan ke substrat melalui serangkaian pengemban, yaitu FLAMIN, gugus-gugus sulfhidril suatu protein kecil, sepasang besi yang menghasilkan radikal tirosil dan kemudian kembali sepasang gugus sulfhidril yang lain. Ribonukleotida reduktase mengkatalisis tahap akhir dengan Stokiometri sebagai berikut

Ribonukleosida difosfat + R Deoksiribosanukleosida difosfat + R

Ribonukleotida Reduktase terdiri atas 2 subunit, B1 (Dimer 172 kD) dan B2 (Dimer 87 kD). Setiap rantai B1 pengatur alosterik dan satu pasang gugus sulfhidril yang berperan sebagai donor electron langsung pada reaksi reduksi pada unit ribosa. B2 berperan pada reaksi katalisis melalui pembuatan radikal bebas yang istimewa pada setiap rantainya. Sub unit B1 dan B2 bersama membentuk situs katalitik enzim.

Gambar 29-13
Setiap rantai sub unit b2 mengandung suatu radiakal Tirosil (Y.) yang stabil dengan suatu electron yang tidak berpasangan pada cincin aromatiknya. Radikal bebas yang tidak biasa ini dihasilkan oleh pusat besi yang terletak berdekatan, terdiri atas 2 ion Fe 3+ yang dihubungkan oleh suatu atom oksigen dalam status bervalensi 2. B2 aktif dibentuk dari apoprotein dan Fe 2+ bila ada O2 dan suatu tiol.
Pada sintesis Doeksiribosanukleotida, gugus hidroksil yang terikat pada C-2 cincin ribosa digantikan secara stereospesifik oleh H. Tidak ada atom hidrogen lain yang dimasukkan atau dikeluarkan. Radikal tirosin memainkan peran katalitik dan bukan peran stoikiometrik dalam reaksi ini. Pada dasarnya mekanisme itu ialah pemindahan sementara sifat-sifat radikal dari enzim kepada substrat. Elektron yang tidak berpasangan bergerak dari tirosin pada B2 ke sistem pada B1 yang kemudian menarik atom H dari C-3 pada unit Ribosa (Gambar 29-14). Hadirnya radiakal pada C-3 di unit ribosa membantu mengeluarkan OH- dari C-2. Dioksiribosa kemudian dibentuk melalui reduksi C-2 oleh tiol pada sub unit B1. Atom H yang ditarik oleh radikal itu pada waktu yang sama dikembalikan ke C-3.

Gambar 29-14
Pembentukan radikal bebas yang stabil memerlukan O2. Lalu bagaimana E. Coli mereduksi Ribonukleotida pada kondisi anaerob?
Suatu Ribonukleotida reduktase yang lain akan bekerja bila tidak terdapat O2. Kembali sebuah radikal bebas yang stabil dihasilkan, tetapi dengan cara yang berbeda. Suatu pusat yang mengandung besi belerang dan bukan suatu pusat dengan besi-oksigen, membentuk radikal bebas itu. S. Adenosil Metionin terikat pada enzim dan suatu 5’-Deoksiadenosil dihasilkan. Elektron bebas pada radikal itu akan berimigrasi ke situs yang bersebelahan dengan substrat ribonukleosida trifosfat untuk menginisiasi katalisis. Pada Ribonukleotida reduktase Lactobacillus leichmannii suatu radikal bebas adenosil kobalamin dihasilkan dari koenzim B12. Mengapa semua Ribonukleotida Reduktase yang telah diketahui tergantung pada suatu radikal untuk pelaksanaan reaksi katalisisnya? Jawaban
Mungkin disebabkan oleh rumitnya reaksi tersebut. Tidak ada perubahan lain selain –H yang menggantikan –OH yang terlaksana pada konversi Ribonukleotida menjadi Deoksiribonukleotida.
Spesifitas substrat dan Aktivitas Katalitik Ribonukleotida Reduktase dikontrol Secara Tepat
Reduksi Ribonukleotida menjadi Deoksiribonukleotida dikontrol secara tepat melalui interaksi alosterik. Setiap polipeptida sub unit B1 Ribonukleotida Reduktase aerobik E. Coli mempunyai dua situs alosterik: satu diantanya mengontrol aktivitas keseluruhan enzim tersebut sedangkan yang lainnya mengatur kespesifikan substrat yang (Gambar 29-13). Aktivitas katalitik Ribonukleotida Reduktase secara keseluruhan berkurang bila terjadi pengikatan dengan dATP, yang merupakan sinyal bahwa Deoksiribosanukleotida telah berlebihan. Inhibisi secara umpan balik ini dibalikan oleh pengikatan ATP. Pengikatan dATP atau ATP pada situs pengontrol yang spesifik untuk substrat itu meningkatkan reduksi nukleotida Pirimidin UDP dan CDP. Reduksi GDP berlanjut pada pengikatan dTTP yang juga menyebabkan terhambatnya kebanyakan reduksi Ribonukleotida Pirimidin. Peningkatan kadar dGTP yang terjadi berikut ini akan menyebabkan terpacunya reduksi ADP. Terbukti bahwa Ribonukleotida Reduktase mempunyai bermacam-mecam bentuk konformasi, setiap bentuk dengan sifat-sifat katalitik yang berbeda pola pengaturan yang sangat kompleks ini menjamin kecukupan persediaan keempat Deoksi Ribonukleotida yang diperlukan untuk sintesis DNA.

UDP dUDP
CDP dCDP

GDP dGDP

ADP dADP

Tioredoksin dan Glutaredoksin mengantar elektron ke Ribonukleotida Reduktase.
Bagaimana caranya elektron dipindahkan dari NADPH ke gugus sulfhidril yang terdapat pada situs katalitik Ribonukleotida Reduktase Aerob?
Salah satu pengangkut tenaga pereduksi ini ialah Tioredoksin yaitu suatu protein 12-kD yang mempunyai 2 residu Sistein yang terpapar dan berdekatan (Gambar 29-15)

Gambar 29-15
Semua Tioredoksin mulai dari Arkebakteri sampai pada manusia mempunyai urutan sebagai berikut :
Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-
Gugus itu dapat dioksidasi menjadi disulfida pada suatu reaksi yang dikatalisis oleh Ribonukleotida Reduktase. Sebaliknya Tioredoksin yang tereduksi dihasilkan kembali oleh aliran electron yang berasal dari NADPH. Reaksi ini dikatalisis oleh Tioredoksin Reduktase, suatu Flavoprotein. Electron mengalir dari NADPH ke FAD yang terikat pada reduktase itu dan kemudian pada disulfida pada Tioredoksin yang tereduktasi.

Gambar Struktur

Tioredoksin merupakan suatu donor elektron tidak hanya pada reduksi Ribonukleotida. Ingatlah bahwa Tioredoksin memainkan peranan penting pada pengendalian reaksi gelap pada proses fotosintesis. Pada kloroplas Tioredoksin direduksi oleh Feredoksin bila fotosintesis I sedang aktif. Tioredoksin tereduksi mengatur aktivitas enzim pada banyak macam sel melalui reduksi disulfida menjadi tiol.
Tioredoksin tidak hanya merupakan pengangkut tenaga pereduksi ke Ribonukleotida reduktase. Telah ditemukan suatu muatan E. Coli yang sama sekali tidak mengandung Tioredoksin untuk membentuk Ribonukleotida. Penemuan yag tidak terduga ini menimbulkan gagasan untuk mengisolasi sistem pengangkutan yang kedua. Donor elektron pada muatan ini ternyata adalah Glutation yaitu suatu Tripeptida yang mengandung Sistein. Seperti telah dibicarakan di muka, Glutation Reduktase mengkalisis reduksi glutation teroksidasi (bentuk disulfida) oleh NADPH. Suatu Flavin ikut serta pada reaksi redoks ini seperti pada reaksi yang dikatalisis oleh Tioredodsin Reduktase. Glutaredoksin yaitu suatu protein yang belum jelas sampai sekarang memindahkan tenaga pereduksi dari Glutation kepada Ribonukleotida Reduktase.

Glutation dan Tioredoksin merupakan protein homolog. Khususnya segmen menonjol yang mengandung pasangan tiol, hampir semua pada keduanya.



Deoksitimidila T dihasilkan melalui metilasi Deoksiuridilat
Urasil bukan komponen DNA. DNA mengandung Timin yaitu analog Urasil yang telah termetilasi. Timidilat sintase mengkatalisis reaksi terakhir yaitu : metilasi Deoksiuridilat (dUMP) menjadi Deoksitimidilat (dTMP). Donor metil pada reaksi ini ialah derivat Tetrahidrofolat dan bukan S-Adenosil Metionin. Secara spesifik, karbon metal diperoleh dari N5, N10 Metilintetrahidrofolat (Gambar 29-16).

Gambar Struktur

Dihidrofolat reduktase mengkatalisis regenerasi tetrahidrofolat, suatu pengangkut satu gugus atom karbon
♫ Perlu diingat bahwa pemindahan satu gugus atom karbon dilaksanakan oleh derivate tetrahidrofolat dan bukan oleh dihidrofolat. Oleh karena itu, tetrahidrofolat harus dibentuk kembali dari dihidrofolat yang dihasilkan dari sintesis deoksitimidilat. Hal ini terlaksana oleh dehidrofolat reduktase menggunakan NADPH sebagai pereduksi.

Dihidrofolat + NADPH + H+  tetrahidrofolat + NADP+

♫ Suatu ion hidrida dipindahkan secara langsung dari cincin nikotinamida NADPH ke cincin pteridin pada dihidrofolat (Gambar 29-17). Substrat yang terikat dan donor elektron berada sangat berdekatan.
♫ Sesungguhnya, keduanya hanya terpisah kurang dari jarak normal Van Der Waals – keadaan yang berdesakan ini memudahkan terbentuknya suatu situs transisi untuk pemindahan elektron.


Gambar 29-17
NADP+ (biru) bersinggungan dengan folat (merah) pada situs aktif dihidrofolat reduktase (DHFR). Dengan cara yang hampir sama NADPH berinteraksi dengan dihidrofolat pada reaksi fisiologis. [Digambar menurut 7dfr.pdb.C.Bystroff, S. J. Oatley dan J. Kraut. Biochemistry 29 (1990):3263.]




Berbagai obat-obatan antikanker yang penting menghambat sintesis deoksitimidilat
Sel-sel yang sedang membelah ini memerlukan persediaan deoksitimidilat yang melimpah untuk sintesis DNA. Kerentanan sel-sel ini terhadap hambatan sintesis dTMP telah digunakan dalam khemoterapi kanker. Timidilat sintase dan dihidrofolat reduktase merupakan enzim sasaran pilihan (Gambar 29-18)







Ө

dUMP dTMP
Timidilat
sintase





N5,N10-metilen- Dihidrofolat
tetrahidrofolat
NADPH + H+
Glisin
Dihidrofolat
reduktase Ө
Serin
NADP+
Tetrahidrofolat

Gambar 29-18
Timidilat sintase dan dihidrofolat reduktase merupakan enzim sasaran pilihan pada kemoterapi kanker. Fluorodeoksiuridilat menghambat metilasi dUMP. Analog folat, aminopterin dan metotreksat, menghambat pembentukan kembali tetrahidrofolat.

Fluorasil (atau fluorodeoksiuridin), obat antikanker yan bermanfaat di klinik, diubah in vivo fluorodeoksiuridilat (F-dUMP) ini menghambat secara ireversibel enzim timidilat sintase setelah bekerja sebagai substrat normal pada sebagian dari siklus katalitik itu.
Mula-mula, suatu gugus sulfhidril enzim itu berikatan dengan C-6 pada F-dUMP (Gambar 29-19)

Gambar 29-19
Timidilat sintase dihambat secara ireversibel oleh fluorodeoksiuridilat (F-dUMP). Analog ini membentuk kompleks kovalen dengan residu sulfhidril enzim tersebut (biru) dan metilentetrahidrofolat (kuning).

Metilentetrahidrofolat kemudian berikatan pada C-5 zat antara lain. Sekiranya substrat berupa dUMP, suatu ion hidrida pada folat pada tahap berikutnya digeserkan ke gugus metilen dan suatu proton ditarik dari C-5 nukleotida.
Namun, F+ tidak dapat dikeluarkan dari F-dUMP oleh enzim itu sehingga dikatalisis terhenti setelah pembentukan kompleks kovalen F-dUMP, metilentetrahidrofolat dan gugus sulfhidril enzim itu. Inilah salah satu contoh dari inhibitor yang menyebabkan bunuh diri saat enzim mengubah substrat menjadi inhibitor reaktif yang dengan segera menghambat aktivitas katalitik enzim itu.

Gambar 29-20
Inhibitor kompetitif yang kuat terhadap reduktase.
(A) Obat anti kanker aminopterin dan metotreksat mengandung gugus -NH3 menggantikan gugus -OH pada dihidrofolat. Selain itu, perbedaan pada metotreksat adalah gugus -CH3, pengganti –H pada N10.
(B) Trimetoprim, suatu analog folat yang bersifat anti bakteri.


Sel-sel mamalia yang tumbuh pada biakan yang mengandung metotreksat dapat menjadi resisten terhadap pengaruh hambatannya. Beberapa di antara mutan itu tidak dapat menerima metotreksat disebabkan adanya kerusakan pada sistem transport. Mutan lain dapat menjadi resisten melalui perubahan yang terjadi pada situs aktif dihidrofolat reduktase yang menyebabkan berkurannya kemampuan unuk mengikat metotreksat. Mekanisme yang ketiga terjadinya resisten ialah produksi berlebihan dehidrofolat reduktase akibat amplifikasi gen. Robert Schimke menunjukkan bahwa sel-sel yang memproduksi enzim lebih dari 1000 kali kadar yang dijumpai pada keadaan normal, dirancang secara bertahap sesuai dengan peningkatan kadar obat pada medium. Di antara sel-sel yang dapat memproduksi secara berlebihan itu ada yang mengandung beberapa ratus salinan gen untuk dihidrofolat reduktase. Penelitian mengenai biakan sel ini sangat mendukung pendapat bahwa dosis obat-obatan antikanker harus cukup tinggi untuk mencegah tumbuhnya mutan yang akan menjadi semakin resisten melalui proses amplifikasi gen.

Gambar 29-21
Mikrograf fluoresensi yang memperlihatkan berbagai salinan gen untuk dihidrofolat reduktase setelah pemilihan sel-sel biakan yang diuji terhadap pengaruh resistensi terhadap kadar metotreksat yang tingi. Setiap daerah yang berwarna kuning terang pada tiga kromosom, mengandung ratusan salinan gen. [Seizin Dr. Barbara Trask dan Dr. Joyce Hamlin.]





NAD+, FAD, dan koenzim A berasal dari ATP
 Langkah pertama pada sintesis nikotinamida adenin dinukleotida (NAD+) ialah pembentukan ribonukleotida nikotinat dari nikotinat dan PRPP. Nikotinat (disebut juga niasin) diturunkan dari triptofan. Manusia dapat mensintesis nikotinat sejumlah yang diperlukan bila masukan triptofan melalui makanan mencukupi.
 Meskipun demikian, sejumlah nikotinat yang berasal dari luar tubuh diperlukan bila jumlah triptofan dalam makanan kurang. Kekurangan triptofan dan nikotinat dalam makanan dapat menyebabkan pelagra, yaitu suatu penyakit dengan gejala-gejala dermatitis, diare, dan demensia.
 Suatu tumor endokrin yang menggunakan triptofan dalam jumlah berlebihan untuk sintesis serotonin (5-hidroksitriptamin), suatu hormon dan juga neurotransmitter, dapat menimbulkan gejala-gejala seperti pada pelagra.


Suatu fragmen AMP kemudian dipindahkan dari ATP ke ribonukleotida nikotinat untuk membentuk desamido-NAD+. Langkah terakhir ialah pemindahan gugus amida glutamin ke gugus karboksil nikotinat untuk membentuk NAD+ (Gambar 29-22).
NADP+ berasal dari NAD+ melalui proses fosforilasi gugus hidroksil-2’ pada fragmen adenin ribosa. Pemindahan suatu gugus fosforil dari ATP ini dikatalisis oleh NAD+ kinase.


Gambar 29-22
Sintesis NAD+ dari ribonukleotida nikotinat.

Flavin adenin dinukleotida (FAD) disintesis dari riboflavin dan dua molekul ATP. Riboflavin terfosforilasi oleh ATP dan menghasilkan riboflavin 5’-fosfat (juga disebut flavin mononukleotida). Kemudian dibentuk FAD melalui pemindahan fragmen AMP dari molekul ATP yang kedua ke riboflavin 5’-fosfat.

Riboflavin + ATP  riboflavin 5’-fosfat + ADP

Riboflavin 5’-fosfat + ATP flavin adenin dinukleotida + PPi

Fragmen AMP pada koenzim A juga berasal dari ATP. Suatu persamaan ciri yang terdapat pada biosintesis NAD+, FAD dan KoA ialah pemindahan fragmen AMP dari ATP ke gugus fosfat suatu zat antara yang telah terfosforilasi.
Pirofosfat yang dihasilkan oleh proses kondensasi ini kemudian dihidrolisis menjadi ortofosfat. Seperti juga pada kebanyakan proses biosintesis, sejumlah besar tenaga penggerak termodinamik berasal dari hidrolisis pirofosfat yang dilepaskan.



Purin dikatabolisme pada manusia menjadi kuat

Nukleotida yang terdapat dalam sel terus-menerus mengalami pergantian. Nukleotida dipecah menjadi nukleosida melalui hidrolisis oleh nukleotidase. Pemutusan nukleosida secara fosforilitik menjadi basa bebas dan ribose 1-fosfat (atau deoksiribosa 1-fosfat) dikatalisis oleh nukleosida fosforilase. Ribosa 1-fosfat mengalami isomerisasi oleh fosforibomutase menjadi ribosa 5-fosfat, yaitu suatu substrat untuk sintesis PRPP. Beberapa dari basa-basa itu digunakan kembali untuk membentuk nukleotida melalui jalur penyelamatan (salvage).
Pada jalur degradasi AMP (Gambar 29-23) terdapat satu langkah tambahan. AMP dideaminasi menjadi IMP oleh adenilat deaminase. Gugus 5’-fosfat pada IMP dikeluarkan secara hidrolisis dan ikatan glikosidik diputus oleh Pi untuk menghasilkan hipoxantin, yaitu suatu basa bebas. Xantin oksidase, suatu enzim flavoprotein yang mengandung molybdenum dan besi, mengoksidasi hipoxantin menjadi xantin dan selanjutnya menjadi asam urat. Molekul oksigen yang menjadi oksidan pada kedua reaksi itu direduksi menjadi H2O2, yang kemudian dipecah menjadi H2O dan O2 oleh katalase. Asam urat bentuk keto terdapat dalam keadaan seimbang dengan bentuk enol, yang akan kehilangan sebuah proton pada pH fisiologis untuk membentuk urat. Pada manusia urat merupakan hasil akhir pemecahan purin dan diekskresikan melalui urin.




















PENYAKIT PIRAI DISEBABKAN OLEH KADAR URAT YANG TINGGI DALAM SERUN
• Natrium urat merupakan bentuk terbanyak pada pH netral dan bersifat lebih mudah larut daripada asam urat. Meskipun demikian baytas kelarutannya yg sekitar 7mg/dl (7mg/100ml) pd suhu 300C mjd masalah pada orang dg kadar hasil pemecahan urin ini yg sgt tinggi pada serumnya
• Hiperurikemia dapat menyebabkan terjadinya pirai, yaitu suatu penyakit yg menyaring sendi2 dan ginjal. Peradangan sendi dipicu o/ pengendapan kristal natrium urat ginjal juga dapat rusak akibat penimbunan kristal natrium urat. Suatu gambaran yang jelas mengenai serangan akut penyakit pirai diterangkan o/ Thomas Sydenham, seorang dokter inggris ternama pada abad ke-17, yg mengalami sendiri derita akibat penyakit itu:
• Korban penyakit ini tidur dlm keadaan sehat. Kira2 pukul 2 dini hari dia terbangun o/ rasa sakit yg sangat pd ibu jari kaki; sekali2 juga tumit, pergelangan kaki, atau bagian dorsal kaki. Rasa sakit itu seperti yg ditimbulkan o/ suatu keseleo dan sekaligus seperti tersiram dg air dingin. Kemudian menyusul keadaan menggigil dan gemetar, serta sedikit demam. Rasa sakit yang mula2 masih tertahankan berubah menjadi parah. Bersamaan dg ini gemetar dan menggigil juga bertambah.
• Selang beberapa lama, keadaan ini mencapai puncaknya, meluas ke tulang dan ligament tarsus dan ligamen tarsus dan metrasus. Suatu saat terjadi penarikan dan perobekan ligamen secara kasar—suatu saat rasa sakit bagaikan diterkam dan suatu saat seperti ditekan dan terasa ketat.
• Sementara itu, perasaan pada bagian yang diserang luar biasa dan sangat sensitif, sampai2 tidak sanggup menahan beban sprei atau getaran orang yang sedang berjalan dalam kamar itu. Malam itu dilalui dalam siksaan, tidak dapat tidur, berulang kali memutar bagian yang terserang dan tak hentinya berubah posisi tubuh; bolak-balik badan berlanjut terus bersama dengan rasa sakit pada sendi yang cedera dan semakin parah bila datang serangan sakit menyengat.








• pirai merupakan suatu penyakit metabolik yang diturunkan tetapi kerusakan biokimia pada banyak kasus belum dapat dijelaskan. Pada sebagian kecil pasien pirai terdapat difisiensi enzim hipoxantin-guanin fosforibosil transferase (HGPRT), yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi penyelamatan IMP dan GMP.







• Difisiensi HGPRT menyebabkan berkurangnya sintetis GMP dan IMP melalui jalur penyematan. Peningkatan kadar PRPP yang disebabkan secara nyata mempercepat biosintesis purin melaui jalur DE NOVO. Pembentukan 5-fosforibosil-1-amin yang merupakan zat antara penentu yang pertama, biasanya dibatasi oleh jumlah PRPP yang ada.
• PRPP yang berlebihan juga berpengaruh terhadap inhibisi umpan balik Amidotranferase yang mengkatalisis langkah ini. Penyakit pirai dapat juga timbul dari kelebihan PRPP yang dihasilkan oleh suatu sintetase yang hiperaktif yang pengaturan alosteriknya terganggu.
• Alopurinol, suatu analog hipoxantin, dengan atom N dan C pada posisi 7 & 8 saling bertukar. Digunakan secara luas untuk mengatasi penyakit pirai. Mekanisme kerja alopurinol sangat menarik, karen pada awalnya bertidak sebagai substrat dan kemudian sebagai inhibitor xantin oksidase.
• Oksidasi ini akan menghidroksilasi alopurinol menjadi aloxantin (oksipurinol), yang selanjutnya tetap terikat kuat pada situs aktif. Atom molibdenum pada xantin oksidase ditahan pada status oksidasi +4 oleh pengikatan dari aloxantin dan bukan kembali pada status +6 seperti pada siklus katalitik normal. Disini kita saksikan contoh lain mengenai inhibisi untuk bunuh diri.













• SINTETIS URAT DARI HIPOXANTIN DAN XANTIN SEGERA MENURUN SETELAH PEMBERIAN ALOPURINOL



• Itu sebabnya konsentrasi hipoxantin dan xantin serum meningkat, sedangkan kadar urat menurun. Pembentukan batu asam urat sesungguhnya ditangkal oleh alopurinol dan penderitaan artritis pun menjadi jauh berkurang.
• Demikian juga kecepatan ribonukleotida. Selanjutnya ribonukleotida alopurinol menghambat konvensi PRPP menjadi fosforibosilamin.
• URAT MEMAINKAN PERAN YANG MENGUNTUNGKAN SEBAGAI SUATU ANTIOKSIDAN YANG SANGAT KUAT
• Kadar rata-rata urat dalam manusia mendekati batas kelarutannya. Sebaliknya, pada prosimian (seperti lemur) kadarnya 10x lebih rendah. Peningkatan kadar urat yang nyata terjadi pada evolusi primata. Apakah keuntungan khusus yang diperoleh dari peningkatan urat yang sedemikian tingginya sehingga nyaris menimbulkan pirai pada kebanyakan orang? Ternyata, urat mempunyai aktifitas kerja yang menguntungkan. Urat merupakan pemusnah (scavenger) efesien untuk menyingkirkan spesies oksigen yang sangat reaktif dan berbahaya separti radikal hidroksil, anion superoksida, oksigen singlet, dan zat2 antara hem yang teroksigenasi pada statu Fe dengan valensi tinggi (+4 dan +5). Sesungguhnya urat sebagai antioksidan hampir sama efektifnya dengan askorbat. Peningkatan kadar urat pada manusia dibandingkan dengan kadarnya pada prosimian dan berbagai primata rendah lainnya mungkin secara bermakna menunjang pencapaian umur yang lebih panjang serta rendahnya kemungkinan terkena kanker pada manusia. Dapat kita lihat pada urat, seperti juga pada bilirubin, ekspresi suatu prinsip bahwa berbagai produk akhir pada jalur katabolisme memainkan peran penting sebagai senyawa-senyawa pelindung.
• SINDROMA LESCH-NYHAN : MELUKAI DIRI SENDIRI, RETARDASI MENTAL DAN PRODUKSI URAT YANG BERLEBIH
• Hipoxantin –guanin fosforibosil transferase yang sangat rendah memberi akibat sangat buruk. Kelainan metabolisme ini, yang disandang sejak lahir (inborn eror of metabolism) disebut sindroma lesch-nyhan, dan diekspresikan paling jelas sebagai perilaku untuk menghancurkan diri sendiri secara kompulsif. Pada usia 2 atau 3tahun, anak2 yang menderita penyakit ini mulai menggigit2 jari dan bibirnya. Mereka juga cenderung untuk bersifat agresif terhadap orang lain. Defisiensi mental dan kekakuan adl gejala2 lain sindroma lesch-nyhan itu. Kadar urat yang tingi dalam serum menyebabkan pembentukan batu ginjal pada umur yang muda, diikuti dgn gejala2 pirai beberapa tahun kemudian. Penyakit ini diturunkan sbg kelainan tergantung jenis kelamin (sex-linked) dan bersifat resesif.
• Konsekuensi biokimia bila tidak terdapat HGPRT adl peningkatan kadar PRPP, peningkatan yang nyata biosintesis purin melaui jalur DE NOVO dan produksi urat yang berlebihan.
• Hubunga antara tidak terdapatnya transferase dan gejala2 neurologis yang sangat aneh itu merupakan suatu teka-teki yang belum terpecahkan. Otak mungkin sangat tergantung pada jalur penyelamatan untuk sintesis IMP dan GMP. Dalam keadaan normal, kadar HGPRT di otak lebih daripada di jaringan lainnya. Sebaliknya, aktifitaa amidotransferase yang mengkatalisis langkah yang menentukan pada jalur sintesis DE NOVO agak lebih rendah di otak.
• Alopurinol sangat efektif untuk mengurangi sintesis urat pada sindroma lesch-nyhan. Namun, penderita penyakit ini tidak dapat mengubah alopurinol menjadi ribonukleotida keran tidak memilki hipoxantin-guanin fosforibosil transferase. Oleh karena itu, pemberian alopurinol tidak dapat menurunkan kadar PRPP dan dengan demikian sintesis purin de novo tidak menurun. Lebih2 lagi, alopurinol tidak dapat menurunkan gejala2 neurologis.
• Sindroma lesch-nyhan merupakan petunjuk bahwa adanya jalur penyelamatan untuk sintesis IMP dan GMP bukan tanpa alasan. Tampaknya, jalur penyelamatan itu memiliki peran kritis yang belum sepenuhnya dimengerti. Dengan demikian, hubunga antara jalur de novo dan jalur penyelamatan sintesis purin masih perlu dijelaskan. Lebih2 lagi, sindroma lesch-nyhan menjelaskan bahwa perilaku abnormal, seperti melukai diri sendiri dan sifat bermusuhan yang ekstrim, dapat disebabkan oleh tidak adanya satu enzim saja. Tanpa ragu-ragu, psikiatri akan dapat diuntungkan dari adanya suatu pengertian yang lebih baik mengenai dasar molekuler kelainan mental seperti itu.