Pengenalan NCBI

PENDAHULUAN
NCBI (National Centre for Biotechnology Information) merupakan suatu institusi yang konsen sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. NCBI membuat database yang dapat diakses oleh publik, merangsang riset biologi terkomputasi, mengembangkan software penganalisis data genome, dan menyebarkan informasi biomedical – yang kesemuanya diharapkan mengarah pada pemahaman yang lebih baik tentang proses-proses molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya.
Situs akses NCBI : www.ncbi.nlm.nih.gov.
Salah satu tools yang tersedia dalam situs NCBI ini adalah BLAST.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan suatu alat pencari yang dapat menyesuaikan dan mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu singkat.
Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu :
1. nucleotide blast (blastn) : membandingkan suatu sekuen nukleotida yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida
2. protein blast (blastp) : membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki dengan database sekuen protein
3. blastx : membandingkan produk translasi konsep 6-frame sebuah sekuen nukleotida (translated nucleotide) yang kita miliki dengan database sekuen protein
4. tblastn : membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki dengan database sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame.
5. tblastx : membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida.

Blastn
Blastn dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu sekuen nukleotida meragukan (query sequence) yang kita miliki dengan database nukleotida, sehingga output yang didapat berupa identitas nukleotida tersebut, antara lain nama gen dan spesies penghasil dari sekuen lengkapnya.
LANGKAH KERJA
1. Buka situs www.ncbi.nlm.nih.gov



2. Pilih tool ”BLAST” (klik satu kali), akan muncul tampilan pilihan program BLAST.
Untuk mencari gen suatu sekuen nukleotida dari database nukleotida pilih ”nucleotide blast” (blastn).



3. Setelah tampilan muncul, entri sekuen nukleotida (query) yang akan dicari; pilih seting pencarian dari database ”others” (jika belum diketahui spesiesnya); pilih program ”megablast”; klik ”BLAST” untuk memulai proses searching


4. Hasil searching/ pencarian akan didapat tampilan seperti berikut



5. Hasil blast umumnya akan menghasilkan lebih dari satu sekuen yang bersesuaian. Pilih hasil dengan skor paling tinggi.

6. Klik “Accession” gen terpilih (hasil blastn) untuk keterangan lebih lanjut, (nucleotide origin dan CDS-nya).




7. Klik “G” pada gen terpilih tersebut, akan didapat deskripsi lebih lanjut mengenai gen tersebut.


Jika ingin melihat lokasi gen tersebut pada kromosom, klik “map viewer”.



Klik “Sequence viewer” untuk melihat gambaran letak CDS (coding sequence).

8. Klik “U” pada gen terpilih tersebut, akan didapat homologi protein dari gen terpilih. Pilih spesies yang dikehendaki, misalnya human, klik untuk keterangan lebih lanjut.


Blastp
Blastp dapat digunakan untuk mencari protein homolog dari protein yang kita miliki.
Langkah kerja :
1. Buka situs www.ncbi.nlm.nih.gov
2. Pilih tool ”BLAST” (klik satu kali). Untuk mencari protein homolog dari query asam amino gunakan ”protein blast” (blastp)
3. Setelah tampilan muncul, entri sekuen protein (query) yang akan dicari; pilih seting pencarian dari database (jika membatasi hanya ingin mencari pada spesies tertentu, ketik nama organisme); pilih program ”blastp”; klik ”BLAST” untuk memulai proses searching.
4. Hasil searching akan didapat tampilan seperti berikut:


5. Hasil blast akan menghasilkan lebih dari satu sekuen yang bersesuaian. Pilih hasil dengan skor paling tinggi. Dengan meng-klik referensi akan didapat keterangan lebih lanjut tentang protein tersebut.



6. Analisis selanjutnya mirip dengan blastn di atas (mencari letaknya, homologi, dsb).


HOMOLOGI
Protein merupakan polipeptida yang tersusun atas asam amino. Sekuens asam amino dari masing-masing protein ditentukan oleh gen yang meng-kodenya. Gen ditranskripsi menjadi mRNA dan selanjutnya mRNA ditranslasikan menjadi protein oleh ribosom. mRNA, merupakan nukleotida yang terdiri atas phosphat, gula deoksi dan basa. Urutan basa yang berbeda akan menghasilkan asam amino dan protein yang berbeda. Beberapa organisme mungkin memiliki jenis protein yang sama, misalnya insulin terdapat pada manusia, babi, kera, kuda, dan beberapa hewan mamalia lainnya. Fungsi insulin pada masing-masing organisme tersebut adalah sama namun ternyata memiliki struktur primer yang tidak sama, sehingga manusia tidak dapat dengan mudah memakai produk insulin dari sembarang organisme untuk terapi supaya tidak menimbulkan reaksi antigen-antibodi.
Oleh sebab itu diperlukan penelitian mengenai homologi protein antar-organisme sehinga dapat dibandingkan kemiripan asam amino yang menyusun protein. Melalui program blastp yang terdapat pada situs NCBI ini kita dapat mencari protein sehomolog dari berbagai macam organisme. Homologi bukan berarti sama persis, namun terdapat kemiripan antara satu dengan yang lainnya dengan persen kemiripan tertentu. Untuk tujuan terapi, misalnya diinginkan suatu protein pengganti dari hewan tertentu, tentu akan dipilih protein yang memiliki persen kemiripan yang paling tinggi dengan protein yang kita miliki, sehingga diharapkan reaksi alergi tidak terjadi dan protein tersebut dapat bekerja dengan baik sesuai dengan yang diharapkan.

TUGAS
1. Mahasiswa akan diberi suatu sekuen nukleotida tertentu (query), cari tahu tentang identitas gen tersebut (cari keterangan tentang nama gen, organisme penghasilnya, origin sekuen, CDS, posisinya pada kromosom)!
2. Cari homologi protein tersebut pada manusia. Cantumkan nama gen dan protein yang dihasilkan serta keterangan lainnya sebagaimana no. 1!
Secara skematis (no. 1 & 2) :






3. Jelaskan istilah homolog, ortholog dan paralog, berikan contohnya!

II. ANALISIS EKSPRESI GEN DAN REGULASINYA

TUJUAN
1. Mahasiswa memahami prinsip ekspresi gen yang meliputi transkripsi dan translasi serta regulasinya.
2. Mahasiswa dapat mengidentifikasi bagian gen yang berperan sebagai promoter, coding sequence (CDS), intron dan ekson, start dan stop kodon, serta regulating element.
3. Mahasiswa dapat memahami bagaimana satu gen yang sama dapat menghasilkan protein yang berbeda.
4. Mahasiswa dapat memahami terjadinya mekanisme splicing dan modifikasi post translasi.

PENDAHULUAN
Sel-sel penyusun tubuh organisme tidak semuanya sama, melainkan memiliki variasi yang tinggi sesuai dengan fungsi yang diperankannya meskipun kandungan genomiknya sama. Adanya variasi tersebut disebabkan karena adanya perbedaan pola ketersediaan protein pada masing-masing sel, atau dengan kata lain disebabkan karena perbedaan pola ekspresi gen.
Ekspresi gen pada dasarnya merupakan suatu proses sintesis protein. Proses ekspresi gen ini ditentukan oleh sel itu sendiri. Jika sel tersebut membutuhkan suatu protein maka gen tertentu akan diekspresikan, namun jika sel tersebut tidak membutuhkan protein maka gen tersebut tidak diekspresikan. Jadi tidak semua gen akan diekspresikan pada saat yang bersamaan namun tergantung dari kebutuhan sel tersebut.

Proses ekspresi gen yang meliputi transkripsi, splicing dan translasi

Reaksi dasar dari sintesis protein adalah pembentukan ikatan polipeptida antara gugus karboksil dari asam amino yang akan tumbuh dengan gugus amina dari asam amino bebas. Reaksi sintesis protein ini membutuhkan cetakan atau template yaitu mRNA, dimana mRNA diperoleh dari hasil transkripsi DNA. Sintesis protein diawali dari proses inisiasi, yaitu berikatannya dua sub unit ribosom dengan mRNA pada daerah spesifik, yaitu 10-30 nukleotida pada daerah upstream dari start kodon. Proses inisiasi memerlukan suatu kodon spesifik yaitu AUG (menyadi asam amino metionin).
Setelah proses inisiasi selesai maka dilanjutkan dengan terjadinya proses perpanjangan (elongasi). Pada proses perpanjangan rantai polipeptida ini dapat dikatakan melewati siklus yang terdiri dari 3 tahap. Pertama molekul amino asil tRNA akan terikat pada A-site yang kosong dengan jalan berikatan dengan kodon dari mRNA yang terdapat pada A-site. Kedua, gugus karboksil akhir dari rantai polipeptid akan terlepas dari molekul tRNA yang ada pada P-site dan membentuk ikatan polipeptida dengan gugus amino dari asam amino yang terikat pada tRNA dalam A-site. Reaksi ini dikatalisis oleh suatu enzim peptidil transferase. Ketiga, peptidil transferase yang baru terbentuk dalam A-site tersebut kemudian dipindahkan ke P-site saat ribosom bergerak ke depan sepanjang tiga nukleotida dari m-RNA. Pada saat proses translokasi tahap tiga tersebut, tRNA bebas yang semula menduduki P-site akan terlepas dari ribosom dan masuk sitoplasma, dan setelah proses ketiga selesai, A-site akan kosong dan siap menerima molekul tRNA yang baru dan mulailah siklus seperti tadi lagi. Proses perpanjangan ini akan terus berlangsung sampai akhirnya ribosom mengenali salah satu dari tiga stop kodon yakni UAA, UAG, dan UGA sehingga sintesis protein akan mengalami terminasi dan rantai polipeptida yang sudah terbentuk tadi akan lepas dari ribosom.
Pada percobaan kali ini mahasiswa akan mempelajari dogma utama dalam biologi molekuler, yaitu transkripsi DNA menjadi mRNA dan translasi mRNA menjadi protein yang dengan istilah ekspresi gen. Mahasiswa harus sudah mendapatkan sekuen nukleotida dan protein pada Homo sapiens yang ditugaskan. Percobaan ini akan dimulai dengan melihat gambaran genom dan sekuen nukleotid terkait untuk memahami prinsip dari ekspresi gen. Selanjutnya, proses transkripsi dan translasi akan dilakukan tahap demi tahap dengan menggunakan Open Reading Frame finder (ORF finder).

LANGKAH KERJA
GAMBARAN UMUM DALAM EKSPRESI GEN
























Proses terjadinya ekspresi gen dengan menggunakan Open Reading Frame finder (ORF finder)
1. Buka halaman awal pada http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ dan temukan tampilan ORF finder (di bawah Map Viewer).
2. Masukkan bagian gen yang merupakan CDS ke dalam ORF finder.
3. Tampilan ORF akan muncul dengan menunjukkan 6 cara pembacaan CDS (six frames). Temukan cara pembacaan (frame) mana yang sesuai untuk menghasilkan protein yang diinginkan (yang sesuai target). Untuk itu, klik frame-nya untuk melihat urutan asam amino yang dihasilkan, kemudian lihat cara pembacaan CDS (pada kotak sebelah kanan). Frame yang tepat dapat juga diketahui dengan mencocokkan arah pembacaan dan urutan asam amino yang muncul pada tampilan sequence viewer.

TUGAS
1. Kerjakan analisis gen dan protein sebagaimana yang diuraikan pada langkah kerja di atas terhadap sekuens yang ditentukan atau diberikan pada waktu praktikum!
2. Cari penyakit-penyakit yang terkait dengan gen (kelainan genetik) atau protein target. Berikan penjelasan bagaimana kaitan antara gen/ protein dengan penyakit yang disebutkan!
3. Berikan juga penjelasan mengenai penyebab munculnya penyakit tersebut dan terapi yang sering digunakan!



III. ANALISIS DOMAIN PROTEIN FUNGSIONAL DAN TRANSDUKSI SINYAL

TUJUAN
1. Mahasiswa dapat memahami karakteristik dari protein target yang meliputi struktur tiga dimensi dan hydrophaty plot-nya.
2. Mahasiswa dapat mengetahui domain fungsional dari protein target dan fungsinya.
3. Mahasiswa dapat memahami peran protein target dalam transduksi sinyal di dalam sel.

PENDAHULUAN
Pengetahuan mengenai struktur biologi saat ini menjadi sangat penting, misalnya pemahaman mengenai struktur protein. Karena dengan itu kita akan dapat mempelajari dan memahami mekanisme kerja enzim, ikatan ligan yang mengatur suatu fungsi, serta desain obat dan inhibitor obat baru.
Struktur sekunder protein pada dasarnya ada dua macam, yaitu  helix dan  sheet. Beberapa protein murni helix, dan beberapa protein lainnya murni  sheet. Namun, kebanyakan adalah kombinasi dari keduanya. Konbinasi tertentu dari  helix dan  sheet disebut struktur super sekunder atau disebut MOTIF. Macam motif:  motif (yang paling umum),  hairpin (anti parallel strands connected by reverse turns),  motif (two successive anti-parallel  helices which are packed with their axes inclined),  barrel ( sheet rolling up into barrels), helix-loop-helix (helix turn helix), leusine zipper motif (dimerization/trimerization motif). Motif-motif tersebut bergabung membentuk suatu struktur protein yang disebut domain.
DOMAIN merupakan suatu unit dari protein yang independent secara struktural yang memiliki karakteristik berupa protein globular kecil. Bentuk domain antara lain : / barrel, four helix bundle, / saddle, / sandwich. Domain bertanggung jawab terhadap aktivitas protein dan biasanya memiliki fungsi yang spesifik. Pembagian domain menurut fungsinya: DNA binding domains, RNA binding domains, ligand (regulatory) domains, oligomerization domains. Gen Bank Database dapat dimanfaatkan untuk melacak keberadaan motif dan domain tersebut. Dari database tersebut dapat diketahui protein yang berbeda yang memiliki motif dan domain yang sama, dan mereka digolongkan dalam satu FAMILY.


LANGKAH KERJA
Analisis Domain Protein Fungsional
1. Buka situs web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ dan pilih pada kolom Search: Conserved Domains, for: isikan target protein (misal: opg). Klik Go


2. Tampilan kedua, muncul accession number dari protein target. Klik accession number tersebut untuk melihat profil dari protein target.


3. Tampilan ketiga, muncul keterangan mengenai protein, struktur 3D, kaitan dengan protein lain dan perbandingan asam amino pada domain fungsional dengan domain pada protein lain. Klik bagian-bagian tertentu untuk melihat keterangan lebih lanjut.
Perhatikan tampilan paling atas:


Klik See full description untuk melihat keterangan lengkap mengenai protein target.

Tekan tanda panah ke bawah di bagian Evidence, kemudian pilih View Structure atau Cn3D untuk melihat struktur 3D dan penjelasan tentang protein target. Jika gambar tidak bisa dibuka, sebelumnya perlu dilakukan install software Cn3D 4.1 yang sudah tersedia pada situs NCBI.
.

Struktur 3D dari protein juga dapat dicari lewat NCBI structure.


Tampilan protein yang muncul juga dapat dilihat strukturnya melalui link ke PDB (Protein Data Bank) atau dilakukan pencarian langsung pada situs http://www.rscb.org/pdb./home/home.do


4. Perhatikan bagian paling bawah dari tampilan Conserved Domains. Pada bagian ini ditampilkan susunan asam amino protein yang homolog pada organism yang berbeda. Range asam amino yang berwarna merah menunjukkan persentase kemiripan asam amino yang tinggi sedangkan yang berwarna biru perbedaannya lebih tinggi. Lakukan analisis terhadap domain protein target dan 2 protein yang memiliki homologi!


HYDROPATHY
Salah satu karakteristik protein adalah hidrofilisitas/hidrofobisitasnya atau sering disebut hydropathy. Hydropathy plot dari protein dapat digunakan untuk memperkirakan posisi protein di dalam sel. Protein yang hidrofobisitasnya tinggi cenderung berada di membran sedangkan protein yang hidrofilitasnya lebih tinggi akan menempati sitosol. Protein yang berada pada posisi transmembran akan memiliki gambaran hydropathy yang khas pula. Mahasiswa ditugaskan untuk mencari dan menganalisis hydropathy plot dari protein target dengan memasukkan rangkaian asam aminonya pada kolom hydropathy analysis yang tersedia pada alamat situs http://www.tcdb.org/progs/hydro.php.

Tekan Click here to plot.




Tampilan hidropathy plot yang akan muncul:


Analisis hydropathy juga dapat dilakukan secara manual dengan menggunakan tabel di bawah ini. Kelemahan metode ini, selain memakan waktu, tidak dapat dilakukan perkiraan protein dengan posisi transmembran atau terletak pada perbatasan membran.

Hydrophobicity Scales
Kyte-Doolittle Hopp-Woods

Alanine 1.8 -0.5
Arginine -4.5 3.0
Asparagine -3.5 0.2
Aspartic acid -3.5 3.0
Cysteine 2.5 -1.0
Glutamine -3.5 0.2
Glutamic acid -3.5 3.0
Glycine -0.4 0.0
Histidine -3.2 -0.5
Isoleucine 4.5 -1.8
Leucine 3.8 -1.8
Lysine -3.9 3.0
Methionine 1.9 -1.3
Phenylalanine 2.8 -2.5
Proline -1.6 0.0
Serine -0.8 0.3
Threonine -0.7 -0.4
Tryptophan -0.9 -3.4
Tyrosine -1.3 -2.3
Valine 4.2 -1.5

Situs lain yang bisa dibuka:
http://www.clcbio.com/index.php?id=460,http://www.genome.ad.jp/dbget/aaindex.html, http://www.vivo.colostate.edu/molkit/hydropathy/scales.html


TRANSDUKSI SINYAL
Proses transkripsi diatur oleh beberapa regulator, utamanya adalah jenis protein Faktor Transkripsi atau Aktivator Transkripsi. Protein jenis tersebut merupakan protein yang mampu mengenali sekuen pendek pada daerah upstream suatu gen sehingga menjalankan RNA polimerase untuk melakukan transkripsi. Protein tersebut dapat diaktivasi atau diinaktivasi karena rangsang ekstraseluler melalui proses yang dinamakan tansduksi sinyal (signal transduction).
Transduksi sinyal merupakan proses penerusan sinyal (pesan) yang berupa rangsang dari luar sel (extra celluler stimulus/stimulator) melalui mediator intraseluler menuju ke dalam inti sel untuk mempengaruhi ekspresi gen dalam rangka memberikan tanggapan sesuai dengan kebutuhan lingkungan (cell environment).
 Stimulator transduksi sinyal (selanjutnya disebut Ligan) dapat berupa molekul kecil (misalnya hormon), tapi umumnya berupa polipeptida/protein. Stimulator memiliki reseptor spesifik yang akan diaktifkan bila terjadi kompleks antara ligan-reseptor.
 Mediator intraseluler dapat berupa molekul kecil atau protein sesuai dengan jenis sinyalnya.
 Terminal effector (efektor akhir) dari transduksi sinyal umumnya berupa Faktor Transkripsi atau disebut juga Aktivator transkripsi sehingga dapat berakibat menghambat atau mengaktifkan transkripsi.
Menurut sifat stimulatornya, transduksi sinyal dapat dibedakan menjadi 2:
1. Stimulator yang dapat larut dalam lipid (Lipid soluble) sehingga dapat langsung masuk ke dalam sitosol dan membentuk kompleks dengan reseptornya di dalam sel. Jenis transduksi sinyal ini merupakan jenis yang sederhana.
2. Stimulator yang tidak larut dalam lipid (Lipid insoluble) sehingga tidak dapat menembus membran sel. Jenis stimulator ini mempunyai reseptor di membran sel.


Contoh mekanisme transduksi sinyal:


Mekanisme transduksi sinyal secara langsung melalui hormon steroid. Sebelum ada hormon, GR berikatan dengan Hsp90 (GR inaktif). Hormon yang lipid soluble melewati membran sel kemudian berikatan dengan Ligand-Binding Domain (LBD) dari GR sehingga konformasi GR berubah dan Hsp90 terlepas. GR lalu menuju ke nukleus dan bagian DNA binding Domain dari GR akan mengenli sekuen spesifik dalam DNA yang disebut Glucocorticoid Response Element (GRE) dan melakukan ikatan (binding). Dalam hal ini GR bertindak sebagai Aktivator Transkripsi, dan bagian Activation Domain akan memacu proses transkripsi gen.

Pencarian pathway/cascade tansduksi sinyal dapat dilakukan salah satunya melalui situs NCBI, dengan jalan sbb:
1. www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. klik NCI-CGAP
3. klik CGAP
4. klik Pathways
5. muncul View pathways dengan 2 pilihan tampilan pathways, yaitu
a. Biocharta pathway on CGAP
b. KEGG pathway on CGAP
6. Pada masing-masing pilihan terdapat index pathway bermacam-macam transduksi sinyal yang dapat dilihat gambar pathway-nya.

TUGAS
1. Lakukan analisis domain protein fungsional sebagaimana yang diuraikan pada langkah kerja di atas terhadap protein yang ditentukan atau diberikan pada waktu praktikum!
2. Lakukan analisis hydropathy sebagaimana yang diuraikan pada langkah kerja di atas terhadap protein yang ditentukan atau diberikan pada waktu praktikum!
3. Lakukan analisis transduksi sinyal untuk mencari posisi protein target pada jalur tansduksi sinyal (signal transduction pathway) di dalam sel dan menjelaskan peran dan regulasinya!
LAPORAN AKHIR
Sebagai contoh penyusunan laporan akhir, dapat dilihat situ pada alamat:
http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/genomics.html pada bagian student web pages.